Протокол, продемонстрированый здесь, может помочь прояснить биосинтез инозитол полифосфатов растений и ответить на вопросы об их роли в некоторых аспектах метаболизма и развития растений. Этот метод является весьма чувствительным, поскольку использование радиоактивно маркированного предшественника фосфатов инозитол позволяет надежно выявлять все виды инозитол фосфатов в растениях. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что большинство биологов растений не знакомы с анализом HPLC и необходимой установкой.
Кроме того, критические шаги этого протокола, такие как извлечения фосфатов инозитол, трудно следовать без надлежащей демонстрации. Начните с создания системы, состоящей из двух независимых насосов HPLC, один для буфера И один для буфера B.Both насосы должны управляться вместе с помощью компьютера или мастер насоса. Осуществление поршневой уплотнения мыть для обоих насосов, либо с помощью гравитационных сил или через третий насос низкого давления.
Подключите оба насоса к динамическому смеситель, а затем подключить смеситель к клапану впрыска с образцом петли, которая имеет по крайней мере один миллилитр мощности. Используйте капилляры для подключения клапана впрыска к столбецу и столбецу к коллектору фракций. Посеять семена лотоса в один ряд на площади Петри блюда заполнены твердых средств роста, состоящий из 0,8% бактериологических агар в деионизированной воде.
Разрешить семена стратифицировать, по крайней мере три дня при четырех градусах по Цельсию в темноте. Поместите семена в инкубатор роста. Передача от 10 до 20 саженцев в один колодец из 12-хорошо ясно плоской нижней пластины культуры клеток заполнены двумя миллилитров полу прочности MS соли раствор, который дополняется 1%сахарозы и скорректированы до рН 5,7.
Добавьте 45 микрокури 3H мио-инозитол в тарелку и закружить его осторожно. Обложка пластины с крышкой и запечатать его с микропорной хирургической лентой. Затем поместите его обратно в инкубатор роста.
После пяти дней маркировки, удалить саженцы из средств массовой информации и мыть их кратко с деионизированной водой. Высушите их бумажными полотенцами и перенесите в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку, чтобы не перезаполнить трубку. Привязать заморозить трубку в жидком азоте и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до извлечения.
Возьмите образцы из морозильной камеры и держать их в жидком азоте до готовности к использованию. Измельчить их с microcentrifuge трубки пестик, пока они не начнут оттаивать, а затем добавить 500 микролитров ледяной буфер добычи. Продолжайте шлифовку, пока образец не гомогенизирован и раствор не будет окрашен.
Центрифуга образцов в течение 10 минут при 18000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Затем перенесите супернатант в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Трубы, используемые для добычи, считаются твердыми радиоактивными отходами и должны быть утилизированы соответствующим образом.
Аккуратно добавьте в экстракт 300 микролитров буфера нейтрализации, что сразу же вызовет осадки белков и восходящее. Через минуту смешайте образец с наконечником пипетки и пипеткой пять микролитров на бумаге рН, чтобы убедиться, что рН составляет от семи до восьми. При необходимости добавьте небольшое количество буфера нейтрализации или буфера извлечения до достижения желаемого рН и дайте образцам отдохнуть на льду в течение по крайней мере одного часа с открытой крышкой.
Затем центрифугировать их в течение 10 минут и передать супернатант в свежей 1,5 миллилитровой трубки. Оборудуйте коллектор фракции 96 небольшими сцинтилляционными флаконами и заполните каждый флакон двумя миллилитров подходящего сцинтилляционного коктейля, совместимого с низкими буферами рН и высокими концентрациями фосфатов аммония. Запустите систему HPLC, затем активируйте промывку поршневых уплотнеек и активируйте ее в течение всего пробега.
Вручную ввит образец подходящим шприцем. Запустите насосы и градиент. В то время как запуск HPLC продолжается, регулярно проверяйте давление.
Стартовое давление должно быть около 18 до 24 бар и должны медленно расти до 50 до 60 бар, как только 100%буфер B достигнут. После запуска, закрыть флаконы плотно и энергично встряхнуть фракции с сцинтилляции коктейль для смешивания. Если не продолжать непосредственно с измерением, держать флаконы в вертикальном положении в темноте.
Чтобы измерить фракции, вставьте флаконы в стойки счетчика сцинтилляции с помощью стеллажей, которые соответствуют небольшим флаконам и измеряют каждый флакон в течение пяти минут в жидком счетчике сцинтилляции. Подготовье диаграмму 2D-линии, на которой измеренные отсчеты в минуту или CPM построены в соответствии со временем удержания. Для сравнения образцов друг с другом нормализуйте данные путем подведения итогов CPM с каждой элализованной фракции с минуты 25 до 96 для каждой отдельной выборки и путем деления общего CPM от этой выборки на общий CPM других образцов.
Для выполнения относительных количественных показателей некоторых пиков поликозола и последующего создания барных графиков, содержащих данные репликаций для статистического анализа, продолжайте анализ с помощью специализированного программного обеспечения, которое может вычислить пиковые области хроматограмм. Полный спектр инозитол полифосфата, полученный из экстрактов A.thaliana после подсчета сцинтилляции, показан здесь. Пики красиво разделены и могут быть назначены различным изоме.
При использовании выдержавного столбца видно явное снижение инозитолового гексакифосфата и отсутствие инозитолового пирофосфата. Анализ SAX-HPLC был также проведен на саженцах L.japonica, которые были выращены и помечены в тех же условиях, что и саженцы арабидопсиса. Хотя предположительно все инозитол полифосфат видов и пиков, которые известны из Arabidopsis можно увидеть, Есть различия в относительном количестве конкретных инозитол полифосфат изомеров между двумя видами.
Чтобы продемонстрировать, что образцы не должны быть проанализированы сразу после извлечения, один образец был разделен на две части и половина его была проанализирована на следующий день после хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Различия между профилями свежих и замороженных образцов SAX-HPLC не были значительными, что продемонстрировало, что один цикл замораживания-оттепели не вредит образцу и что сам метод дает воспроизводимые результаты. При попытке этого протокола, всегда молоть образцы тщательно, замороженные и с буфером извлечения, и стремиться к близкому к нейтральному рН после нейтрализации, чтобы обеспечить максимальное восстановление радио-помечены инозитол фосфат для анализа SAX-HPLC.
Можно очистить радио помечены от SAX-HPLC запустить для более позднего использования, например, во взаимных реакциях путем сбора фракций без сцинтилляции коктейлей и измерения только небольшие aliquots.
