Мы представляем впервые новый подход к воспроизводимой и масштабируемой генерации, клеток IPS, полученных в мозжечковых органоидах, и химически определенные условия, использующие биореакторы с одним использованием. Чтобы получить клетки для посева биореатра, добавьте один миллилитр клеточной отслоения среды, к каждому колодец из шести хорошо пластины человека iPSC's. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение семи минут, пока не нежное встряхивание легко отделяет клетки, от колодец.
Используя микропайпец P 1000, трубят клеточное отслоение среды, вверх и вниз, пока клетки не разобщаются в одиночные клетки. Далее добавьте два миллилитров, полной среды культуры клеток к каждому хорошо, это будет инактивировать энзиматическое пищеварение. Затем используйте пипетку, чтобы аккуратно перенести клетки в стерильную коническую трубку.
Центрифуга трубки при 210 раз тяжести в течение трех минут. Удалите супернатант и повторно приостановив гранулы клеток в среде культуры. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и попробуйте синий краситель.
Посмотрите на сосуд биореактора с iPSC с плотностью 250 000 клеток на миллилитр. Вставьте сосуд биореактора в универсальный базовый блок в инкубатор при 37 градусах Цельсия, влажности 95% и 5%углекислом газе. Для содействия агрегированию iPSC установите агитационный курс базового блока управления до 27 об/мин.
В первый день, когда нулевой день является днем посева биореактора, поместите биореактор и базовый блок в стерильный капюшон потока, а затем используйте серологическую пипетку, чтобы собрать один миллилитр образца клеточной подвески. Плита подвески ячейки в ультра низкой крепления, 24 хорошо пластины. Используйте микроскоп, чтобы подтвердить, что iPSC производные агрегаты сформировались.
Если это так, захват изображения агрегатов на 40 X или 100 X.Продолжить культивирование iPSC и биореактор, до среднего диаметра агрегатов, составляет 100 микрометров, а затем заменить 80% среды, со свежим MT01 без ингибитора породы. Когда агрегаты достигают от 200 до 250 микрометров в диаметре, пусть все органоиды оседают, в нижней части биореактора, а затем заменить все оттраченные среды, с gfCDM дифференциации среды. Поместите базовый блок и биореактор в инкубатор и уменьшите агитацию до 25 об/мин.
После удаления супернатанта из хранящихся органоидов, добавить один миллилитр 15%сахарозы в гранулы, и хорошо перемешать, закрученного мягко. После инкубации органоидов на ночь, при четырех градусах по Цельсию, удалите раствор сахарозы, затем добавьте один миллилитр 15%сахарозы, 7,5% желатина и быстро перемешайте, аккуратно закрученные. В то время как органоиды инкубируют при 37 градусах по Цельсию заполнить пластиковый контейнер на полпути с 15% сахарозы 7,5%желатиновый раствор, и дать ему затвердеть.
После того, как органоиды были инкубации в течение одного часа, используйте пастер пипетку, чтобы поместить каплю органоидной сахарозы желатиновой смеси, на вершине затвердевания сахарозы и желатина. После ожидания 15 минут для падения затвердеть, заполнить оставшуюся часть пластикового контейнера, с более чем 15% сахарозы, 7,5% желатина, дайте ему затвердеть полностью при комнатной температуре, а затем инкубировать его в течение 20 минут при четырех градусах цельсия. Разрежьте желатин на кубик, с органоидами в центре, зафиксните куб к куску картона, с каплей соединения OCT, затем поместьте 250 миллилитров изопентанов, в чашку 500 миллилитров, заполните соответствующий контейнер жидким азотом.
Используя типсы и толстые перчатки, аккуратно поместите чашку изопентанов на поверхность жидкого азота. Изопентан и жидкий азот являются опасными реагентами. Для использования этих двух реагентов требуется средства индивидуальной защиты, включая толстые перчатки и адекватную вентиляцию.
Когда изопентан остынет до отрицательных 80 градусов по Цельсию, поместите кубик желатина в изопентан до тех пор, пока он не замерзнет. Хорошо замороженный куб, производит металлический звук, когда слегка постучал с типсами, указывая, что он готов к хранимому. Вымойте микроскоп слайды, содержащие органоидные секции, с 50 миллилитров 1X PBS в течение пяти минут, а затем передать слайды в банку Coplin, содержащий свежие 1X PBS.
Перенесите слайды в банку Coplin, содержащую 50 миллилитров свежеприготовленного глицина и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, затем перенесите слайды в банку Coplin, содержащую 50 миллилитров 0,1%Triton, и пронизывает в течение 10 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды дважды с 1X PBS, в течение пяти минут каждый раз. Приготовьте иммуностеинированную тарелку с трехмиллиметровой бумагой, пропитанной 1X PBS.
Высушите горки салфеткой вокруг ломтиков и поместите их на трехмиллиметровую бумагу. С помощью пипетки Pasteur накройте каждый слайд 0,5 миллилитров блокирующего раствора. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, удалить избыток блокирующего раствора и диск слайды с тканью, все вокруг ломтиков.
Поместите 50 микролитров разбавленного первичного антитела на каждый слайд и накройте их крышкой. Кружева слайды, в ранее подготовленных иммуностеинации блюдо, и инкубировать их при четырех градусах по Цельсию. После ночной инкубации, перенесите слайды в банку Coplin, с 50 миллилитров TBST, позволяя крышке скользит упасть, а затем мыть слайды три раза с TBST, в течение пяти минут каждый раз.
Поместите 50 микролитров, разбавленных вторичных антител на каждом слайде, и накройте крышкой скользит. Поместите горки, в ранее приготовленное иммуностейн, инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Перенесите слайды в банку Coplin снова, и мыть их три раза с 50 миллилитров TBST, в течение пяти минут каждый раз.
Использование Pasteur Pipette, на 0,5 миллилитров раствора dappy, по всей поверхности каждой горки и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. После 24 часов в биореакторе, iPSC эффективно формируется сфероидной формы агрегатов. Морфология была в хорошо поддерживается до пяти дней, с постепенным увеличением размера.
Демонстрация высокой степени однородности. Количественный анализ с помощью микроскопии также показал нормальное распределение совокупных размеров на первый день, и обе клеточные линии достигли оптимального совокупного размера на второй день. После достижения желаемого совокупного диаметра была индуцирована нервная приверженность, а затем было повышено поколение различных мозжечковых прародителей.
Во время дифференциации органоиды показали более выраженную эпителиализацию, похожую на нервные трубоподобные структуры с светящимся пространством. Кроме того, распределение органоидного диаметра, было однородным во время первоначального мозжечкового обязательства до 14-го дня. Иммунофлюоресценция анализ подтверждает, что эффективная нейронная приверженность, из iPSC производных органоидов, уже достигнута, на седьмой день дифференциации.
Иммуностимулирование также продемонстрировало, эффективную мозжечковую приверженность и эффективное созревание мозжечковых органоидов. Кроме того, после 80 дней в биореакторе, живые мертвые окрашивания органоидов показали высокую жизнеспособность клеток, и никаких доказательств некротических областях. Этот метод представляет собой важный инструмент, для изучения патологических путей, участвующих в дегенерации мозжечка наблюдается в и для оценки терапевтического эффекта новых препаратов.
