Наш протокол обеспечивает трехмерные и крупномасштабные виды позвоночных лимфатических сосудов и их дренажных лимфатических узлов, облегчая изучение лимфатического дренажа и лимфатического движения иммунных клеток. Протокол очистки iDISCO сохраняет целостность тканей, позволяя локализации нервных, сосудистых и иммунных клеток позвоночного столба, включая спинной мозг, опоясывания, эпидуральное пространство и дренажные лимфатические узлы. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс в анестезии 8 до 12 недель мышь, поместите мышь в стереотаксис кадра.
И использовать скальпель, чтобы сделать разрез кожи в соответствующей области для запланированной инъекции. Используйте спинномозговой адаптер для обездвиживания спинного мозга на уровне позвонков Th12-L1 и тупо вскрыть парацервические или параспинаальные мышцы, покрывающие шею и колонку, чтобы визуализировать поверхность dura mater. Затем используйте 26 калибровочных игл, чтобы тщательно перемежать центральную область dura mater и подкладки арахноида.
Затем вырежьте два миллиметра от кончика стеклянной капиллярной крышки и соедините капилляр с канюлей, связанной со шприцем из 10 микролитров. Загрузите микрокапулятор двумя-восемью микролитров флуоресцентного трассировщика выбора. И ввести микро капилляр в медиальной области dura матер под соответствующим углом для запланированной инъекции.
Нажатие капилляра на 1,5 миллиметра ниже dura mater, закрыть разрез вокруг капилляра с 10 микролитров хирургического клея. Когда клей высохнет медленно вводить флуоресцентный трассировщик со скоростью одного микролитр в минуту. Когда весь том был доставлен оставить капилляр на месте в течение одной минуты, прежде чем отказаться от микро-капилляров.
И закройте отверстие для инъекций дополнительным клеем. В соответствующее время после инъекции используйте ножницы для вскрытия кожи и перитонеальные разрезы от нижней части живота до грудной клетки. Откройте грудную клетку, чтобы получить доступ к сердцу и вставьте 26 калибровочных игл в левый желудочек сердца.
Perfuse с 20 миллилитров ледяной 4%paraformaldehyde в PBS, со скоростью двух миллилитров в минуту. И используйте ножницы, чтобы быстро сократить правого атриума, выпуская поток перфузионой жидкости. Используйте типсы, чтобы полностью удалить кожу и удалить конечности ножницами.
Удалить все внутренние органы, заботясь, чтобы оставить лимфатические узлы нетронутыми и сократить ребра. Погрузите вскрытые ткани в ледяной 4%paraformaldehyde в PBS в отдельных 50 миллилитров труб на ночь при четырех градусах по Цельсию, перед мытьем фиксированных тканей три раза в 50 миллилитров свежего PBS, в течение пяти минут за стирку. Для iDISCO-маркировки цельно-монтажных образцов во-первых, обезвоживать ткани с последовательным погружением в восходящих концентрациях метанола в PBS в течение одного часа за погружение с возбуждением при комнатной температуре.
После последнего погружения инкубировать образцы в 33%метанол, 66%dichloromethane раствор ночь с возбуждением. На следующее утро, мыть образцы два раза со 100%метанолом в течение одного часа на стирку при комнатной температуре. Затем ночная инкубация в 5%перекиси водорода в метаноле при четырех градусах по Цельсию.
На следующее утро регидратировать образцы постепенно в последовательных погружений в нисходящих концентрациях метанола в PBS в течение одного часа на концентрацию с возбуждением при комнатной температуре. Для декалькордификации позвонков инкубируют образцы в растворе Морзе в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем два полоскания в PBS и два, один час инкубации, в 0,2%Triton X-100 в PBS, с волнением при комнатной температуре.
После второй инкубации Triton X-100 в течение 24 часов обработать образцы раствором пермяки при 37 градусах цельсия. Затем 24-часовая инкубация в блокирующий раствор при 37 градусах по Цельсию. В конце блокирующего раствора инкубационная этикетка образцов с первичными антителами, разбавленных в 0,2%Tween-20 и 0,1% гепарина в PBS, дополненных 5%диметилсуульфоксидом и 3%ослиным раствором сыворотки при 37 градусах Цельсия в течение шести дней.
В конце инкубации, мыть образцы с четырех до пяти ночных инкубаций в свежем 2%Tween-20 и 0,1% гепарин в PBS на стирку при комнатной температуре с возбуждением. Затем инкубировать образцы вторичными антителами в соответствии с рукописными указаниями. После последней стирки обезвоживают образцы с последовательными погружениями в восходящие концентрации метанола в ПБС в течение одного часа на концентрацию.
Затем ночная инкубация в 33%метанол 66%дихлорметановый раствор. На следующее утро, мыть образцы с двумя 15-минутный дихлорметан моет. И очистить образцы в дибензил эфира без встряхивания в течение четырех часов.
Для изображения микроскопии листа светового листа поместите очищенные образцы в поперечную плоскость в стадии микроскопа под целью 4X, 0.3. И выберите одностороннюю конфигурацию три листа с фиксированной позицией X без динамической фокусировки. Используйте светодиодные лазеры, настроенные на 561 нанометров и 100 милливатт и 639 нанометров и 70 милливатт.
И установите световой лист численной диафрагмы до 0,03. Установите соответствующие фильтры выбросов и заполните микроскоп камеры с дибензил эфира. Далее, используйте камеру, чтобы приобрести стеки с 2,5 микрометра стеки и 30 миллисекундного времени экспозиции на шаг с помощью двух X оптический зум и 0,8 микрометра на пиксель.
И выполнять мозаичные приобретения с 10%-ным перекрытием на полном кадре. Приобретайте изображения в формате TIF и преобразуйте их в 3D-формат с соответствующей программой полного преобразования. Для реконструкции мозаики приобретение с stitcher программного обеспечения открыть изображения и вручную организовать изображения, чтобы воссоздать всю мозаичную картину, используя 10% перекрытия между изображениями в качестве руководства.
Затем используйте 3D-программное обеспечение для генерации ортогональных проекций данных. Добавление атрибута цветового кода к лимфатическим сосудам и другим анатомическим структурам на дисплее. И установить гамма-коррекцию 1,47 к необработанным данным, полученным из флуоресцентной микроскопии светового листа.
в соответствии с инструкциями производителя. Сочетание iDISCO с световой листовой флуоресцентной микроскопией сохраняет анатомию позвонков и позволяет захватывать лимфатическую сосудообразуемость в окружающих костях, связках, мышцах и нервных ганглиях. Инъекция небольшого красного флуоресцентного трассировщика в спинномозговую жидкость головного мозга, цистерна магна или грудной отдел спинного мозга приводит к накоплению трассировщика в глубоких лимфатических узлах шейки матки через 45 минут после инъекции, что указывает на поглощение и дренаж трассировщика лимфатической системой.
Инъекция tracer в грудной отдел позвоночника parenchyma приводит к накоплению трассировщика в тканях спинного мозга и глубоких шейных дренажных лимфатических узлов, но не в шейном и грудном лимфатических сосудах, помеченных анти-LYVE-1 антителами. Анти-LYVE инъекции в грудной отдел позвоночника parenchyma приводит к маркировке как позвонков лимфатических и их вне позвонков лимфатических связей. Обоснование поглощения трассировщика позвоночными лимфатическими сосудами и лимфатический дренаж в направлении вне позвоночной лимфатической системы.
Выполните инъекцию следа очень тщательно, чтобы не беспокоить, что циркуляция CSF. Протокол iDISCO очень официозный, но вам нужно адаптироваться к размеру ваших образцов. После инъекции следов в центральную нервную систему иммунное окрашивание или живой эксперимент изображения может быть AUS-выполнено.
Протокол iDISCO может быть использован для изучения различных клеток, популяций и тканей.
