Существует большое количество химических веществ EDC в нашей среде, в основном эстрогенных веществ. Химическое разнообразие веществ, принадлежащих к группе, затрудняет их тестирование, поскольку для их обнаружения требуются различные методы. Основываясь на химической структуре, это действительно трудно определить, если вещество на самом деле в состоянии работать как эстроген.
Кроме того, эти вещества никогда не присутствуют в чистом виде в окружающей среде, поэтому их воздействие может зависеть и от других соединений. Эта проблема решается с помощью методов диалектинга эффекта, таких как использование биомониторов, биоидицаторов организмов, которые показывают эффект эстрогена. Известно, что некоторые гены чутко реагируют на эстроген в живых организмах.
Обнаружение генных продуктов молекулярными методами также возможно на уровне белка или мРНК, но обычно включает в себя жертвоприношение животных. Законы о защите животных становятся все более строгими, и растет спрос на альтернативные системы испытаний. Кросс-генетические технологии представляют возможность с этим развитием и с открытием флуоресцентных белков, путь для создания биомаркера были вымощены.
С помощью такой активации эстроген чувствительных генов можно проверить in vivo. В этом видео, возможный метод для использования vtg:1mCherry трансгенных эмбрионов зебры в настоящее время показано для тестирования эстрогенных веществ с помощью двух соединений. Протокол может служить фоном для изучения эстрогена эффект различных химических или экологических образцов на эмбрионы биомаркеров.
Линия зебры, используемая в наших экспериментах, является трансгенной линией зебры- Линия была создана с помощью системы Tol2 Transposon. Конструкция трансгена, используемая для разработки, носила длинную природную последовательность промоутеров вителлогенина-1 с большим количеством сторон ERI.
Выражение флуоресцентного сигнала у сексуально зрелой самки непрерывно. Однако у самцов в эмбрионах он появляется только под действием или наличием эстрогенных веществ, поэтому последние больше подходят для тестирования. Чувствительность и удобство использования эмбрионов линии были протестированы на нескольких эстрогенных соединений, а также на экологических образцов.
Все эксперименты на живых животных были проведены в соответствии с Венгерским законом о защите животных, и все исследования были завершены до того, как животные достигли стадии бесплатного кормления. Заполните брачные резервуары системной водой и найте рыбу для спаривания перед сбором яиц. Поместите самку и самку рыбы в бак и разделите их с помощью разделизера.
Удалите разделитель из баков, как свет включается на следующее утро. Проверьте брачные цистерны на яйца каждые 15-20 минут. Урожай всех эмбрионов с помощью чайного ситечко, или плотно сплетены, тонкая сетка, и объединить их в одну большую чашку Петри с буфером E3, или чистой системной воды.
Поместите эмбрионы в инкубаторы, установленные до 25,5 градусов по Цельсию. Через полтора-полтора после этого удалите и выбросьте неутверейтеные или недостаточно разделенные яйца с пластиковой трубкой под рассеченным микроскопом. Поместите отобранные эмбрионы в сосуды обработки, например, в чашки Петри или пластины культуры тканей, которые уже были помечены и заполнены различными концентрациями испытательного вещества.
Инкубировать эмбрионы при 25,5 градусах по Цельсию до конца эксперимента. Освежите решение теста, если это необходимо для поддержания концентрации лечения. Будьте осторожны при изменении тестового раствора, чтобы избежать повреждения эмбрионов.
Подготовка четыре процента methoseladose с мс 222 заранее. Поместите пятидневные личинки в пятиметровую чашку Петри на группу обработки пластиковой пипеткой. Удалить лечебный раствор из личинок с пластиковой пипеткой, а затем заполнить чашку Петри с двумя миллилитров 0,02 процента мс 222 обезболивающего раствора.
Заполните каждый квадрат специально разработанной 10-сантиметровой чашки Петри с четырьмя процентами methoseladose ms 222. Перенесите обезболеизированные личинки в метоселадоз с небольшим количеством воды в одном из двух квадратов. С первого квадрата перенесите личинки на вторую площадь.
Во втором квадрате поверните и сориентировать личинки в левую сторону и аккуратно прижать их вниз к нижней части кончика пипетки микрозагрузщика, разрезанной до двух сантиметров. Для того, чтобы оценить сигнал выраженного репортера, изображение эмбрионов в том же виде и настройки. Поместите чашку Петри на сцену микроскопа.
Сосредоточьтесь на печени эмбриона, и захватить яркое изображение поля с помощью ассоциируемого программного обеспечения. Переключите микроскоп на фильтр mCherry и сделайте флуоресцентное изображение печени под флуоресцентным светом с помощью связанного с этим программного обеспечения. Повторите предыдущие два шага, пока вы не захватили все эмбрионы в эксперименте.
Open ImageJ, а затем загрузить флуоресцентное изображение для анализа либо перетаскивания и падения изображения, или нажав на Файл Open. Нажмите на изображение, цвет, сплит каналы, чтобы разделить изображение, сделанное флуоресцентным фильтром в соответствии с цветовой диаграммой RGB. Работа с красным спектром изображения канала.
Закройте другие каналы. Назначьте эллиптической области аналогичного размера на изображении, так что полные сигналы не мешают оценке. Использование овальных инструментов сделать эллипс над выделенной области печени как можно точнее.
Если сигнал слаб, используйте легкие микросхемы изображения, яркую пару поля флуоресцентного изображения, чтобы определить расположение печени. Нажмите на анализ, измерение, чтобы определить силу сигнала и размер зоны. Значение интегрированной плотности автоматически рассчитывается столбец программного обеспечения в диаграмме.
Продолжить анализ, повторяя предыдущие шаги, пока вы не проанализировать все флуоресценции изображения всех эмбрионов в группе лечения. Сохраните данные, а затем проанализируйте интегрированные значения плотности. В эксперименте, эстроген чувствительных эмбрионов биомаркера зебры линии были обработаны с 0,5 и восемь микромоле концентраций альфа-и бета-Зеараленол, или ЗОЛ, для оплодотворения в возрасте до пяти дней.
Мы исследовали, появляются ли флуоресцентные сигналы в печени рыбы к концу эксперимента из-за веществ, и есть ли различия в эстрогенности этих двух веществ. Результаты оценивались на основе флуоресцентных изображений и интегрированных значений плотности. В случае альфа-ЗОЛ, при самой высокой тестовой концентрации, все люди умерли.
Таким образом, в этом случае флуоресцентный сигнал не может быть рассмотрен. При более низких концентрациях в печени эмбриона наблюдается сильный флуоресцентный сигнал. Без существенной разницы в прочности флуоресцентного сигнала и размерах освещенных областей.
Кроме того, не было существенной разницы между значениями интегрированной плотности и методами лечения. Во время лечения бета-ЗОЛ смертности не было. Вещество индуцируется трансгенной активностью во всех концентрациях лечения.
Увеличение интенсивности флуоресцентного сигнала и размер освещенной области можно наблюдать на флуоресцентных изображениях по мере увеличения концентрации. Изучая интегрированные значения бета-ЗОЛ, это изменение также может быть обнаружено. Среднее значение интегрированной плотности почти удваивается между самыми низкими и самыми высокими концентрациями лечения.
Однако в случае бета-ЗОЛ мы не нашли существенной разницы между значениями интегрированной плотности отдельных концентраций. Изучая интегрированные значения плотности, полученные в результате одной и той же концентрации этих двух веществ, можно сказать, что альфа-ЗОЛ дал более высокие средние показатели интегрированной плотности в каждом случае по отношению к бета-ЗОЛ, что согласуется с различиями между силой сигнала, наблюдаемой в флуоресцентных изображениях. Это различие со значительными во всех концентрациях.
Использование биоиндикаторов для эффектов эстрогена распространяется в токсикологических исследованиях. Несколько трансгенных линий, показывающих эффекты эстрогена, также были произведены из зебры, из которых vtg:1mCherry был использован в наших исследованиях. Метод, описанный здесь иллюстрирует возможный протокол для тестирования эмбрионов этой линии, с тем чтобы позволить in vivo обнаружения активности эстрогена в случае чистых агентов.
Важно отметить, что в случае эмбрионов экспрессия трансгена, подобно выработке эндогенного вителлогенина, показывает большую дисперсию, и при проектировании экспериментов следует учитывать различия в индивидуальной чувствительности. Важным аспектом в определении концентраций лечения является то, что клетки эмбрионов, в том числе клетки печени, могут быть повреждены более высокими концентрациями высокотоксичных веществ, что может привести к снижению индукции вителлогенина. Поэтому тесты должны проводиться в концентрациях ниже L-C 10.
Этот протокол может быть изменен во многих точках в соответствии с запланированными конечной точками тестирования, а также в образцах, которые будут протестированы. Она может быть завершена с другими методами тестирования, например, молекулярные методы. Таким образом, мы надеемся, что использование линии vtg:1mCherry появится в качестве модели эстрогенных тестов, а также может быть моделью для стандартизированных методов тестирования.
