Это протокол для изоляции первичных стволовых клеток мышц мыши для изучения метаболизма ex vivo. Этот протокол обеспечивает гораздо большую популяцию стволовых клеток по сравнению с другими протоколами, которые мы пробовали в прошлом. И что важно, как только мы дифференцидим эти стволовые клетки на миотрубы, они демонстрируют нормальную физиологию, так что такие вещи, как циркадные ритмы.
При попытке этой процедуры в первый раз, сделать подробные заметки и сохранить несколько изображений, потому что каждая ткань explant выглядит по-разному и не будет вариации в результате миобластов. Без визуальной демонстрации, трудно знать, если вы изолируете правильные клетки. Мы воспользовались щедрой помощью других людей, которые показали нам этот метод, когда мы создали его в нашей лаборатории.
После подготовки блюда к вскрытию в соответствии с рукописью, подготовить влажную камеру, поместив два-три листа толстой абсорбющей бумаги в полиэтиленовый пакет и использовать пипетку, чтобы промокнуть поверхность бумаги стерильной водой. Поместите камеру под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут, чтобы стерилизовать. Вскрыть желаемую мышцу от четырех до восьми недель мыши и аккуратно промыть в PBS, содержащий 40 микрограмм на миллилитр гентамицин для стерилизации.
Используйте стерильные типсы для переноса мышцы в стерильную 10-сантиметровую тарелку Петри без покрытия. Добавьте 0,5 к одному миллилитру покрытия мультимедиа над мышцей таким образом, чтобы ткань была влажной, но не плавающей. Используйте стерильный скальпель или лезвие бритвы, чтобы аккуратно нарезать мышцы небольшими фрагментами.
Используйте типсы или пипетки для переноса фрагментов мышц на поверхность предварительно покрытой шестиметровой пластины. Очень мягко наложить дополнительные 0,8 миллилитров покрытия средств массовой информации над тканью. Поместите шестиметровую тарелку, содержащую фрагменты мышц, во влажную камеру и верните ее в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение 48 часов.
Подготовка и довоенная миобласт сми, трипсин и PBS-гентамицин в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Чтобы покрыть колбу T25 для каждой группы мышц, добавьте два миллилитров раствора покрытия на поверхность колбы, осторожно встряхните, чтобы создать равномерною на поверхности, и инкубировать колбу при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Теперь с пипеткой, удалить покрытие средств массовой информации из мышц explants и осторожно промыть мышцы explants с двумя миллилитров PBS-гентамицин.
Быстро удалите PBS и не позволяйте пластине сидеть в PBS. Затем аккуратно добавьте один миллилитр PBS-гентамицина и поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение одной минуты. Используйте P1000 пипетку для сбора PBS с клетками в 15 миллилитровую центрифугу трубки.
Затем добавьте один миллилитр трипсина в тарелку и верните его в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Аккуратно коснитесь пластин, чтобы выбить миобласты. Соберите трипсин с клетками и объедините с коллекцией PBS.
Добавить восемь миллилитров миобластных средств массовой информации в центрифугу трубки и осторожно инвертировать, чтобы смешать. Аккуратно наложить два миллилитров покрытия раствора на мышечные пластины и вернуть пластины в 37 градусов по Цельсию инкубатор. Спин центрифуг трубки, содержащие клетки в центрифуге в течение трех минут при 200 раз г.
Аспирировать супернатант и держать примерно один миллилитр в трубке. Аккуратно добавьте миобластные средства массовой информации, перенесите клетки в предварительно покрытую колбу и поместите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Аспирировать средства массовой информации из P0 myoblast T25 колбы.
Промыть клетки кратко с двумя миллилитров теплого PBS-гентамицин затем аспирировать PBS из колбы. Pipette два миллилитров теплого PBS в каждой колбе, содержащей миобласты. Поместите колбы с PBS в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение трех минут.
Затем твердо коснитесь стороны колбы, чтобы выбить клетки. Проверьте под световым микроскопом свободно плавающие миобласты. Поместите колбы вертикально в капюшон культуры тканей и промыть дно колбы с 10 миллилитров миобластных средств массовой информации два-три раза, чтобы убедиться, что все клетки выбили.
Соберите смесь клеточных медиа в 15-миллилитровую центрифугу. Центрифуга в течение трех минут при 200 раз г. Аспирировать средства массовой информации, чтобы оставить около одного миллилитра в трубке быть осторожным, чтобы избежать ячейки гранулы.
Аккуратно добавьте соответствующий объем миобластных средств массовой информации в центрифугу трубки и аккуратно перемешать. Распределите клеточную смесь на новые колбы T75 по шесть миллилитров каждая. Добавьте 10 миллилитров миобластных средств массовой информации к каждой новой колбе T75.
Аккуратно встряхните колбы горизонтально, чтобы распределить клетки и поместить их в инкубатор при 37 градусах по Цельсию на ночь. В этом протоколе, первичные клетки вышли из explants наблюдались под стандартным световым микроскопом. Ранние урожаи миобластов казались маленькими круглыми и яркими сферами.
Дифференциация миобластов заняла от четырех до шести дней, в течение которых морфология клеток превратилась из одиночных круглых сфер в удлиненные слитые длинные многонуклеанные волокна. Были дифференцированы полностью миотрубы, которые были готовы к измерению показателей потребления кислорода. Эти ячейки могут быть использованы для ряда приложений вниз по течению.
Например, мы часто используем их для изучения потока субстрата в приборах Seahorse.
