Наш протокол может быть использован для изучения респираторных эффектов лептина на сонной тела в периферической chemoreflex контроля дыхания, и физиологические реакции на гипоксию. Мы также можем оценить последствия потери и усиления функции сонной артерии организма с помощью хирургической и химической денервации и аденовирусной трансфекции соответственно. Перед началом процедуры, измерить температуру внутри обычай сделал все тело plasthemagrophy камеры, и измерить относительную влажность лаборатории.
Затем измерьте вес тела и ректальной температуры экспериментальной мыши. Поместите мышь в камеру и поместите оксиметровый воротник вокруг бритой шеи животного. И не забудьте полностью запечатать камеру, чтобы избежать утечки воздуха.
Подождите около 30 минут, пока мышь не затихло и камера находится в постоянном объеме. Перед началом записи дыхательных сигналов и периферического насыщения кислородом при нормоксии. После 20 минут нормоксии, подвергать животное постоянному смешанному потоку газа 10%кислорода и 3%углекислого газа.
И начать запись первого цикла острой гипоксии в респираторных сигналах и периферического насыщения кислородом. В течение первых 30 секунд гипоксии откройте два небольших боковых порта у основания камеры, чтобы обеспечить в пробках смеси газов. После первых 30 секунд закройте один из небольших боковых портов камеры и продолжайте записывать при постоянной гипоксии на уровне 10% фракции вдохновенного кислорода в течение пяти минут.
В конце лечения гипоксии, переключить источник потока, чтобы повторно подвергать мышь комнатный воздух и позволить животному восстановиться при нормоксии, по крайней мере за 30 минут до начала следующего анализа. В конце эксперимента подключите шприц к одному из небольших боковых портов у основания камеры и трижды ввести один миллилитр комнатного воздуха во всю камеру плетисмографии крови для калибровки камеры. После третьего флеша, измерить температуру в камере с животным еще внутри и камера по-прежнему закрыты.
Затем откройте камеру и измерить ректальной температуры мыши, прежде чем вернуть животное в свою домашнюю клетку. Для хирургического денервации сонных синусовых нервов, управлять анальгезией для анестезии мыши, и удалить волосы в брюшной области шеи. Дезинфицировать обитаемую кожу бетадином и алкоголем и наносить мазь на глаза животного.
После принятия среднего разреза, удалить соединительной и жировой ткани подвергать бифуркации общих сонных артерий и определить гипоглоссальный нерв. Поднимите гипоглоссальный нерв, чтобы разоблачить глоссофарингальный нерв непосредственно внизу и использовать микро-весенние ножницы, чтобы двусторонне вскрыть сонные синусовые нервы. Когда сонные тела подверглись воздействию, аккуратно приостанавливайте один микролитер соответствующего аденовируса в четырех микролитров жидкой матрицы Matrigel на льду, с каждой стороны, и нанесите пять микролитров вирусной суспензии на область сонной артерии на двусторонней основе.
Подождите две-три минуты, пока жидкая матрица Matrigel не затвердеет перед закрытием разреза 6-0 шелковым швом и введением одного миллилитра нормального солевого подкожно. Затем дом мыши в камере восстановления с мониторингом до стернальной лежачих, прежде чем вернуть животное в свою домашнюю клетку. Непрерывное вливание лептина значительно увеличивает гипоксическую вентиляционную реакцию у мышей С57BL/6, в то время как рассечение синусового нерва отменяет это вызванное лептином увеличение.
Как и ожидалось, никаких смягчающих эффектов сонной пазухи нерва вскрытия на гипоксической вентиляционной реакции наблюдаются в группе фиктивной хирургии после вливания лептина. Индукция рецептора лептина долго изоформное выражение в сонной телах рецептора лептина долго изоформы недостаточно ожирением DB / DB мышей приводит к значительному увеличению гипоксической вентиляционной реакции. В то время как после трансфекции с контролем аденовируса Лаки, никаких изменений не наблюдается.
Эти методы позволяют анализ роли сонной тела в периферической chemoreflex и влияние лептина на сонной тела в контроле дыхания.
