Здесь мы демонстрируем, как использовать АТФ-чувствительный датчик FRET ATeam 1.03 YEMK для динамических измерений изменений в уровнях нейронального и астроцитического АТФ в органотипически культурных ломтиках гиппокампа мыши. Основным преимуществом этого метода является то, что можно изучать энергетический метаболизм в живой ткани мозга в контролируемой обстановке, окружающей среде с высоким уровнем экспрессии датчиков. Этот метод может помочь в получении информации о патомеханизмах, основных заболеваниях или повреждении мозга, например, вызванных лишением энергии, таких как ишемический инсульт.
Он может, в принципе, использоваться для изучения уровней АТФ не только в тканях мозга, но и в других органах. Чтобы успешно провести этот эксперимент, необходимо выполнить все этапы, связанные с культивированием ткани чрезвычайно тщательно и поддерживать стерильность. Кроме того, необходимы некоторые знания клеточной флуоресцентной визуализации.
Обработка тканей в самых сложных подходов и визуализации имеет жизненно важное значение для понимания надлежащих процедур. То же самое относится и к экспериментам с визуализацией. Демонстрация процедуры будет Родриго Лерчунди, postdoc, и На Хуан, мастер студент из лаборатории.
В ледяной чашке Петри, наполненной ACSF, поместите мозг на фильтровальную мембрану. Раздельте полушария и выполните паразагиттальный разрез под углом 45 градусов. Зафиксировать одно полушарие на стадии ткани Vibratome с помощью суперклея и немедленно перенести блок ткани в ванну Vibratome, содержащую ледяной ACSF, пузырчатый с 5%углекислым газом и 95%кислородом.
Выровнять ткань в ванне Vibratome. Держите второе полушарие в ледяном ACSF до нарезки. Отрегулируйте vibratome, чтобы сократить ломтики на 250 до 400 микрометров.
После разрезания ломтика, определить образование гиппокампа на основе его типичной морфологической внешности и изолировать его с помощью подкожных игл, сохраняя часть коры головного мозга, прилегающих к гиппокампу. Поместите ломтик на сетку в ACSF, разогретый до 34 градусов по Цельсию и пузырьков с 5%углекислого газа и 95%кислорода, пока все ломтики собраны. Перенесите ломтики в шкаф ламинарного потока, чтобы продолжить в стерильных условиях.
С перевернутой, стерильной, стеклянной трубой Pasteur, аккуратно перенесите ломтики из ACSF в одну из предварительно разогретых чашек Петри, наполненных стерильным раствором Хэнкс'соли. Измените пипетки и перенесите ломтики на второе блюдо культуры. Повторите процесс пять раз в целом.
Перенесите как можно меньше HBSS на следующие культурные пластины. Используя пипетку, аккуратно поместите один кусочек за один раз в верхней части культуры вставки. Избегайте турбулентности в пипетке, и ждать, пока ломтик спускается к кончику пипетки Пастера.
Повторите процесс для каждого ломтика. Поместите два ломтика на мембрану. Тщательно удалите излишки решения Хэнка из верхней части вставки с помощью тонкого наконечника.
Держите культуры во влажном инкубаторе на уровне 5%углекислого газа и 37 градусов по Цельсию до дня эксперимента. Замените носитель каждые два-три дня. Не касаясь ткани, нанесите 0,5 микролитров разбавленного вектора непосредственно на верхнюю часть каждого ломтика.
Наконец, поместите ломтики обратно в инкубатор и поддерживать их там, по крайней мере еще шесть дней. Перед началом эксперимента перенесите вставку, содержащую культурные ломтики, в стерильный капюшон и поместите ее в 30-миллиметровую тарелку, содержащую один миллилитр органотипического ломтика культуры среды, или минимальной необходимой среды. Поместите блюдо под стереоскоп и сосредоточьтесь на поверхности ломтика.
Используйте две стерильные подкожные иглы, чтобы сделать короткий поперечный разрез прямо на узких краях выбранного ломтика, и в верхнем слое, не повреждая ткани под ним. Чтобы удалить подготовленный ломтик из вставки, удерживайте края мембраны пинцетом и используйте стерильный скальпель, чтобы сделать прямые, параллельные разрезы мембраны, образуя квадрат или треугольник с ломтиком в центре. Если в вставке находятся дополнительные срезы, перенесите ее обратно на исходную пластину и в инкубатор.
Поверхностное натяжение среды предотвратит ее утечку на поверхность мембраны. Подготовка экспериментального ACSF и получить рН 7,4, восходящей его с 95%кислорода и 5%углекислого газа через вставленные трубки подключены к карбогена питания, по крайней мере тридцать минут. Держите солевой пузырь в течение всего эксперимента.
Затем включите флуоресцентный источник света монохромера. Перенесите органотипную культуру ломтика в экспериментальную камеру. Поместите сетку поверх органотипической культуры ломтика с рамкой вниз, не касаясь культуры, и нити вверх, касаясь мембраны.
Поместите камеру на сцену микроскопа и соедините ее с системой перфузии. Включите перистальтический насос со скоростью потока от 1,5 до 2,5 миллилитров в минуту. Убедитесь, что нет утечки перфузии системы.
Используя трансмиссионый свет, свяжте культурный кусочек с фокусом и определите область, где должны проводиться эксперименты. Прежде чем начать эксперименты с визуализацией, подождите не менее 15 минут, чтобы позволить срезам адаптироваться к солевым условиям, а затем включите камеру и программное обеспечение для визуализации. Возбуждайте донорский флуоресцентный белок на 435 нанометров.
Установите время экспозиции от 40 до 90 миллисекунд. Затем вставьте дихроическое зеркало и фильтры в блок сплиттера луча. Разделите излучение флуоресценции на 500 нанометров с сплиттером изображения выброса, и и ввестите фильтры пропуска полосы на 482 плюс или минус 16 и 542 плюс или минус 13.5 nanometers для того чтобы более далее изолировать флуоресценцию дарителя и acceptor.
Выберите область интереса, по-видимому лишенную клеточной флуоресценции для фонового вычитания. Обвяжте отдельные структуры помеченной ткани на изображении на экране для создания ИИ. Установите частоту получения изображения и общее время записи.
Для экспериментов продолжительностью более 30 минут рекомендуется частота приобретения от 0,2 до 0,5 Герца для предотвращения фототоксичности. После этого запустите запись. Чтобы вызвать изменения внутриклеточного АТФ, переключите перфузионную трубку со стандартного ACSF на солевой раствор, содержащий метаболические ингибиторы, например, раствор химической ишемии.
Кроме того, используйте солевой раствор с повышенной концентрацией калия в восемь миллимоляра, чтобы имитировать высвобождение иона калия из активных нейронов. Сразу после записи, обмен экспериментального ACSF с кучи буфера ACSF. Затем перенесите камеру записи, содержащую культуру среза, на конфокальный лазерный сканируемый микроскоп.
Возьмите изображения стека с самым высоким разрешением в данной оптической конфигурации. В этом протоколе, через десять дней после трансдукции, нейроны, выражающих ATeam 1.03 YEMK были найдены при высокой плотности в неокортексе культурных ломтиков тканей на глубине до 50 микрометров ниже поверхности среза. Сопоставимые результаты были достигнуты в гиппокампе.
Для астроцитов, ATeam 1.03 YEMK был выражен под контролем человека глиального фибролярного кислого белка промоутер, и органотипические ломтики, выражают ATeam 1.03 YEMK в гиппокампа нейронов выбранных ROIs представляют собой сомата пирамидальных клеток. После разоблачения ломтик 5 миллимолярный азид натрия при отсутствии внеклеточной глюкозы в течение одной минуты, противоположные изменения были вызваны в интенсивности выбросов пары FRET. Наблюдалось также обратимое снижение соотношения ATeam FRET.
Долгосрочное соотношение ATeam FRET в 14 различных клетках в базовых условиях в нейронах и астроцитах показывает, что ATeam является надежным и стабильным датчиком. Обратите внимание, что химическая ишемия привела к ожидаемому сильному падению соотношения ATeam в обоих типах клеток в конце этого эксперимента. Увеличение внеклеточной концентрации калия с трех до восьми миллимолей в течение трех минут не приводит к обнаруживаемым изменениям в нейронах, выражаюющих ATeam 1.03 YEMK.
В отличие от этого, астроциты реагировали на увеличение внеклеточного калия обратимым увеличением соотношения ATeam FRET, что указывает на повышение внутриклеточного уровня АТФ. Опять же, химическая ишемия вызвала немедленное снижение соотношения ATeam, демонстрируя, что датчик может обнаружить изменения в АТФ. При попытке FRET основе клеточной визуализации, как описано здесь, важно иметь в виду, что производство высококачественных ломтиков в органотипических культур является ключевым шагом.
Кроме того, требуется тщательное удаление глиального шрама и визуализация экспертного уровня. После этой процедуры, следует также иметь возможность выполнять эксперимент, включающий различные другие FRET основе наносенсора для клеточных метаболитов. Например, для глюкозы или лактата.
И последнее, но не менее важное, необходимо подчеркнуть, что всегда должны соблюдаться соответствующие акты по защите животных. Это также относится к эффективным законам, регулирующим обращение с генетически модифицированными организмами.
