Этот автоматизированный рабочий процесс обеспечивает последовательное белковое энзимаматическое пищеварение с отличной воспроизводимостью и пропускной способностью. Это повышает точность и надежность обнаружения, проверки и клинического применения биомаркеров с помощью масс-спектрометрии. Преимущество этой технологии заключается в том, что весь рабочий процесс может быть завершен в течение 96 образцов примерно за пять часов с внутриассаймом и межассайным резюме менее 20% для большинства белков.
Этот точный препарат высокой пропускной способности образца позволяет нам исследовать протеомы болезни тканей или биофлюидов в больших масштабах. Кроме того, автоматизированный протеомный рабочий процесс подготовки образца обеспечивает прочную основу для высокого содержания и количественного протеомного анализа. Демонстрация процедуры будет д-р Цинь Фу, директор Центра высокой пропускной способности в Сидар Синай и г-н Кейси Джонсон, научный сотрудник из моей лаборатории.
Перед началом анализа добавьте пять микролитров слитка здоровой человеческой плазмы в 96-ю круглую хорошо пропиленовую пластину. Когда все образцы были загружены, откройте программное обеспечение устройства жидкого обработчика и в соответствии с вкладкой метода, выберите домой все оси для ориентации автоматизированного обработчика жидкости. Подтвердите, что все шприцы рабочей станции не содержат видимых пузырьков воздуха и откройте новый метод и нажмите Run, чтобы инициировать метод.
Введите верно ввести значение для использования для autosampler подскажут иметь автоамперлер пластины подготовлены в конце метода и нажмите OK. Введите один в введите значение для использования для первого столбца подсказки и нажмите OK. Введите 12 в введите значение, чтобы использовать для последнего столбца подсказку и нажмите OK. Если образец пластины используется с объемами выборки не менее 20 микролитров, введите верно в введите значение для использования для образца пластины подсказки и нажмите OK. Следуйте указаниям в окне настройки управляемых Labware и нажмите Продолжить. Загрузите соответствующие реагенты в соответствующие скважины и нажмите Далее. Нажмите далее еще раз, чтобы выложить автоматизированную палубу обработчик жидкости, как показано на иллюстрации, включая реагент, реакцию, образец, и автоамперные пластины, шесть-хорошо 90 микролитровый наконечник коробки, пустой 90 микролитер кончик коробки, и полный 230 микролитров кончик коробки.
Затем нажмите Закончить, чтобы начать метод. При продолжении после центрифугации запрос, получить реакционной пластины и поместить пластину в центрифугу. В конце центрифугации верните реакционной пластины в положение в автоматизированном обработчике жидкости и нажмите Продолжить.
Для жидкой хроматографии и тандемного анализа масс-спектрометрии, решить пептиды в C18 2.1 на 100 миллиметров 3,5 микрометра колонки высокого потока высокого давления жидкой хроматографии с скоростью потока 250 микролитров в минуту и проанализированы в очереди на тройной четырехугольный масс-спектрометр. Через пять минут после загрузки, уравночные столбец с 5%буфер B решение и elute пептиды с линейным 5-35%градиент буфера B в течение 30 минут. В конце элюции, мыть столбец с 98%buffer B в течение 10 минут, а затем пять минут мыть с 5%buffer B перед загрузкой следующего образца.
Для онлайн-утечки используйте двухэтафный клапан переключения, чтобы отвлечь пост-колонку eluent в отходы, прежде чем он войдет в ионный источник. Когда все образцы были эластимы, можно обрабатывать данные мониторинга нескольких реакций. В этом репрезентативном анализе, три бета-гал пептиды и два пептида альбумин были проверены из шипами бета-гал и обработанных белков плазменного альбумин.
Точность рабочего процесса автоматизированной подготовки образца рассчитывалась как процент от коэффициента дисперсии общего протеомного выбранного рабочего процесса мониторинга реакции минус процентный коэффициент дисперсии жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии. Как и ожидалось, хорошие интенсивности сигнала наблюдались как для человеческой сыворотки альбумин и бета-гал белков. Для контроля точности ступеней передачи жидкости, стабильные изотопные пептидные стандарты могут быть шипами для эндогенного человеческого альбумин сыворотки и экзогенного бета-гал белка в независимых реагентов передачи шагов.
Для проверки автоматизированного рабочего процесса подготовки протеомной выборки внутридневной коэффициент дисперсии рассчитывался из 21 скважины, подготовленной в тот же день. Средний внутридневной процентный коэффициент дисперсии для 40 белков варьировался от 4-20%Для оценки краевого эффекта автоматизированного рабочего процесса на основе пластин процентный коэффициент дисперсии может быть рассчитан из конкретных скважин в пределах обозначенных столбцов и рядов. В этом репрезентативном эксперименте интенсивности сигнала множественного мониторинга реакции были схожи во всех конфигурациях столбца и строки с процентным коэффициентом дисперсии от 3-22%Наиболее важными шагами являются правильное добавление образца в соответствии с желаемой 96-ну картой пластины и правильное настройка реагентной пластины в соответствии с инструкцией программного обеспечения.
Этот автоматизированный метод подготовки протеомных образцов позволяет исследователям собирать надежные и количественные данные протеомии в больших масштабах.
