Этот метод создает парадигму для будущих исследований, предоставляя исследователям надежную и переводную модель сотрясения мозга, которая позволяет продольной характеристики молекулярных эффектов сотрясения мозга. Эта модель крысы сочетает в себе микродиализ, позволяющий непрерывную аналитическую количественную оценку с методом обертывания клина, прилагая быстрое ускорение и замедление головы и туловища, что имитирует важную особенность черепно-мозговой травмы человека. Последствия этого метода распространяются на терапевтические исследования сотрясения мозга, поскольку он предлагает ценную возможность для изучения механизма и эффективности фармакологических агентов in vivo и непрерывно.
Настоятельно рекомендуется работать в командах по два человека во время сотрясения мозга и фиктивных индукционных шагов этого метода, чтобы ограничить ошибки манипуляции и максимизировать эффективность во время эксперимента. Демонстрацией процедуры будет Хлоя Провост, техник в нашей лаборатории. Чтобы начать процедуру, побрить голову животного с помощью электрического клипера.
Очистите бритую область, используя раствор 2%изопропиловый спирт и 2%хлоргексидин глюконат три раза. Затем нанесите смазочковую мазь глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Затем поместите крысу в стереотаксис.
Вставьте ушные батончики в ушные каналы с большой осторожностью и затяните зажим носа. После этого, исправить 26 калибровочных нержавеющей стали руководство канюля на руку держателя на стереотаксис аппарата. Сделайте разрез средней линии в три сантиметра на коже головы.
Оставьте череп ясным, установив четыре зажима вокруг разреза. Очистите периостеум твердо от черепа хирургическим лезвием до тех пор, пока не будут видны брегма и швы лямбды. Если есть кровотечение, поддерживать твердое давление на череп с марлевой площадкой или хлопка наконечником аппликатора.
Подтвердите, правильно ли выровнен череп на стереотаксисном аппарате, сравнив дорсовентальные координаты швов брегмы и лямбды. Определите антеропостер, mediolateral, и dorsoventral координаты шва брегмы в качестве ориентиров для координат канюли руководства. Затем, взяв координаты шва брегмы в качестве ссылок, вычислите координаты места имплантации канюли в гиппокампе.
Отметйте точное место имплантации с помощью маркера. Впоследствии просверлите отверстие диаметром 0,5 миллиметра через череп в целевом месте направляющий канюли. Просверлите три других отверстия примерно пять миллиметров вокруг этой точки, чтобы нить три якорных винта в череп, который будет затвердевать канюлю после акрилового зубного цемента применяется.
Затем вставьте канюлю в гиппокамп и починьте его зубным цементом. Будьте осторожны, чтобы не пролить избыток зубного цемента вокруг места, где вес будет сброшен. Оставьте цемент высохнуть в течение двух минут, а затем удалить руку держателя из канюли.
Вставьте съемный обтуратор из нержавеющей стали в канюлю, чтобы избежать просачивания спинномозговой жидкости и риска заражения. После этого снимите четыре зажима, оттяните убранную кожу и сшив ее хирургической шовной нитью. Затем удалите крысу из аппарата и ввимите бупренорфин подкожно для лечения боли.
Поместите грызуна обратно в клетку с грелкой под ним, пока он не станет сознательным. Затем верните его в учреждение по уходу за животными на семидневный период восстановления под пристальным наблюдением. В этой процедуре, удалить обтуратор из канюли и вставить зонд микродиализа медленно.
Затем зафиксировать сборку зонда на пружине из нержавеющей стали, привязанной к жидкому повороту и уравновешивающей рычагу руки с кольцевой поддавки и зажимами, чтобы животное мог свободно перемещаться в своей клетке. Привязанные крысы имеют доступ к пище и воде в течение всей процедуры микродиализа. Используйте микроинфузионный насос для доставки перфуза к зонду и сбора диализа из линии розетки сплавленного кремнезема.
По крайней мере, за один час и 30 минут до начала процедуры, включите зонд к его рабочей скорости потока на один микролитер в минуту. Убедитесь, что скорость потока зонда соответствует измерению объема с течением времени с помощью пипетки. После этого соберите каждый образец диализа в фракционные флаконы, предварительно загруженные одним микролитером 0,25 моль на литр перхлорной кислоты, чтобы предотвратить деградацию аналита.
Храните образец на уровне четырех градусов по Цельсию для последующего анализа. После того, как последний образец собран, удалить микродиализ зонд из канюли и восстановить обтуратор, прежде чем вернуть крысу в учреждение по уходу за животными. Чтобы установить сотрясение аппарата, лента алюминиевый лист плотно U-образный оргстекла кадр, который содержит пенную подушку.
Используйте острый лезвие бритвы, чтобы сделать щели в алюминиевом листе. Лента прорези алюминиевого листа. Затем распоить раму плексигласа под направляющей трубкой из ПВХ.
Держите ПВХ направляющий трубки на месте с зажимом стоять на 3-1/2 сантиметров выше прорези алюминия. Прикрепите нейлон летать лесопромысловые линии через металлическую петлю так, что в нижней части веса составляет 2-1/2 сантиметров над прорези алюминия, чтобы предотвратить несколько хитов, когда крыса падает на пену подушку после удара. Затем прикрепите нейлоновую лесную линию мухи к стенду зажима.
Поднимите вес через трубку ПВХ с нейлоновой нахилой лески. Держите его на месте, вставив ключ hex через предварительные просверленные отверстия на один метр выше прорези алюминиевой фольги. Чтобы вызвать сотрясение мозга, поместите животное на грудь на прорези алюминиевого листа так, что его голова расположена непосредственно на пути латуни вес.
Снимите конус носа и потяните ключ hex. Вес будет падать вертикально через трубку ПВХ и ударяться о голову крысы. В результате крыса претерпит быстрое вращение на 180 градусов и приземлится на спину.
Снимите крысу с пенной подушки и поместите ее на спину в клетку. Используйте цифровой таймер для измерения правильного рефлекторного времени в знак восстановления и тяжести травмы. Правильный рефлекс время общее время от удара, пока крыса просыпается и спонтанно поворачивает обратно в положение склонны или начинает ходить.
Обратите внимание на признаки смерти, перелома или кровотечения. Для фиктивной индукции поместите животное на грудь на прорези алюминиевого листа так, чтобы его голова лежит прямо на пути латуни веса. Снимите конус носа, а затем удалить животное из алюминиевого листа, не потянув шестиугольный ключ.
После этого поместите крысу на спину в клетку. Используйте цифровой таймер для измерения времени пользования в качестве индикатора неврологического восстановления. У животных из пострадавшей группы в среднем значительно увеличилось время выправования по сравнению с фиктивными случаями, и они оказались ошеломлены, придя в сознание.
Из 10 случаев из группы сотрясения мозга, только одно животное показало незначительные признаки кровотечения под местом удара после падения веса. Значительное увеличение внеклеточных концентраций глутамата наблюдалось в области гиппокампа CA1 в течение первых 10 минут после индукции травмы по сравнению с фиктивной травмой. Пожалуйста, помните, во время индукции сотрясение мозга избежать воздействия канюли с весом, как это будет генерировать травмы ядра крысы, которые являются значительно более серьезными, чем сотрясение мозга.
Этот метод может быть применен к изучению повторных сотрясений мозга, так как процедура является близкой травмы головы, которые могут быть повторены на тех же животных в разных точках времени.
