Протокол трансфекции nanoDispenser, разработанный для описания в этом видео, представляет собой первый удобный для пользователя метод трансфекции с высокой пропускной способностью, позволяющий даже новичкам в этой области быть успешными. Это легко на высокой пропускной способности техника позволяет трансфекции клеток с 384 независимым состоянием. В настоящее время метод является низкой стоимости из-за нано объем реагента необходимо.
Чтобы определить наилучшие параметры трансфекции для всех типов клеток, мы предлагаем сохранить постоянную концентрацию ДНК источника и использовать различное количество трансфицированной ДНК, реагент трансфекции и количество клеток. Для дозирования подвески 40 микролитровых клеток, смонтировать 10 микролитров кассеты на перистальтической жидкости обработчик устройства, и подготовить соответствующую программу. Во-первых, отрегулируйте параметр скорости потока до низкого, чтобы распределить клетки с низкой скоростью, чтобы избежать потенциального повреждения клеток отвесным стрессом и высоким воздействием на дно скважин.
Затем отрегулируйте высоту диспенсации до 11,43 миллиметра. Высота должна быть достаточно высокой, чтобы снизить воздействие ячейки на дно скважин во время процесса дозирования, но достаточно низкой, чтобы избежать удержания капель на распределительной головки. Затем отрегулируйте ровную высоту пластины до 16 миллиметров, чтобы позволить свободное смещение дозаторной головки над пластиной после раздачи каждого ряда.
Визуально контролировать надлежащие настройки перистальтической жидкости обработчик головы высотой. Убедитесь, что капли не сохраняются на диспенсервных советах при раздаче. Также убедитесь, что голова достаточно высока, чтобы позволить смещения головы после дозирования каждого ряда.
Для создания списков выбора для управления ADE-диспенсацией был разработан удобный макрос электронной таблицы для управления количествами ДНК и смешивания до четырех плазмидов в формате пластины 384 хорошо. Оптимальные объемы предварительно заполнены в некоторых ячейках электронной таблицы, но могут быть изменены. В розовых полях реагент трансфекции, или значение смеси TR, установлен на 500 нанолитров.
Минимальное значение объема в скважинах source plate установлено до четырех микролитров, а максимальный объем в скважинах исходных пластин до 11,25 микролитров. Введите 100 нанограмм на микролитер ДНК, начиная концентрации в синих полях, соответствующих основной ДНК. Затем введите нужное количество ДНК в серых и зеленых полях, соответствующих 384 скважина пластины.
Введите количества и плазмидные имена и убедитесь, что одно и то же правописание используется, если одна и та же плазмида должна быть трансфицирована в нескольких скважинах. Нажмите на пик-листы генерации для проверки введенных значений и, если хотите, исправите заполненные оранжевым цветом ячейки, указывающие на ошибки или объемы, которые не могут быть обработаны NanoDispenser. Если ни один из них не обнаружен, макрос будет генерировать 384 хорошо дозирования руководства, файл списка ДНК, и TR picklist файл из данных, собранных на соответствующих листах.
Печать шаблона из листа источника пластины, чтобы визуализировать скважины, которые будут заполнены перед раздачей. Указаны имена плазмидов и минимальные объемы заполнения. Объемы трансфектной реагентной смеси, которые будут заполнены в следующих скважинах, обозначены как TR и выделены зеленым цветом.
Чтобы подготовить ДНК-источник пластины, разбавить хранимую плазмиду ДНК до 100 нанограмм на микролитер с помощью дистиллированной воды. Теперь откалибровать 384 хорошо сетки до размеров пластины. Откройте 384 Well Pipetting Guide Application на планшете.
Поместите место источника на сетке на нижнем экране. В левом верхнем меню калибровки нажмите плюс-минус, чтобы увеличить или уменьшить размер сетки и колодцев, чтобы настроить зеленые колодцы на четыре угловых скважины пластины. Используя двустороннюю ленту, смонтировать 3D печатный адаптер пластины на экране, чтобы избежать движения исходных пластин при раздаче.
При необходимости перемести откалиброванные сетки с помощью стрелки вращения и вверх, вниз, вправо, влево кнопки, чтобы настроить сетку к положению пластины. После того, как сетка и размеры хорошо правильно откалиброваны и расположены, отметьте коробку калибровки замка. Нажмите на файл и откройте 384-Wells-Pipetting-Guide.
csv файл. Следуйте инструкциям экрана, чтобы вручную распределить указанный объем плазмиды в указанной концентрации в белый выделенный колодец, который соответствует правильному целевому назначению ожидаемой пластины. Используйте минус или плюс стрелки, чтобы вернуться назад или дальше в процессе дозирования ДНК.
Прекратите выдачу по достижении первого трансфектного реагентного раствора для загрузки. Как только диспенсации ДНК будут закончены, удалите источник пластины из адаптера. Если несколько исходных пластин должны быть заполнены, поместите новую плиту источника на адаптер и следуйте инструкциям по дозированию.
Центрифуга ДНК заполнены исходные пластины для обеспечения надлежащего жидкого выравнивания и удаления пузырьков, ведущих к неточности в ADE базовых переводов. Теперь запустите опрос для управления вручную дозированными томами. На ПК NanoDispenser запустите программу NanoDispenser.
Перейдите на диагностическую вкладку, пометьте из коробки с исходными пластинами, загрузите источник пластины на держатель пластины и зажмийте, чтобы войти в тарелку. При запросе выберите 384LDV_AQ_B2 для настройки NanoDispenser в режиме обхода буфера и нажмите OK. Выберите опрос в разное меню. И нажмите на запуск.
Выберите предварительно заполненные скважины для анализа и нажмите на кнопку Go. Убедитесь, что измеренные объемы соответствуют ожидаемым и убедитесь, что скважины не были загружены объемами более 12 микролитров. Премьер трубки с сывороткой свободной среде, заполнив новый стерильный сосуд с 10 миллилитров предварительно разогретой сыворотки свободной среды и погружения трубки организатора в нем.
Нажмите на основную кнопку перистальтической жидкости обработчик около 10 секунд. Убедитесь, что наконечник не засоряется, визуально осматривая поток от распределительной головки. Поместите стерильную пластину культуры 384 хорошо на перистальтический жидкий обработчик пластины перевозчика, и удалить его крышку.
Запустите предварительно откалиброванную программу, чтобы обойтись один микролитер в каждом колодец из 384 пластины хорошо. Время раздачи составляет около восьми секунд. Затем замените крышку пластины 384 хорошо.
Чтобы настроить дозирование ДНК по инициативе ADE, запустите программное обеспечение picklist. Установите 384 скважины, доехав до 384 ЛВ. Установите устройство в режим обхода буфера, выбрав 384LDV_AQ_B2.
И типы пластин назначения, чтобы Greiner_384PS_781096. Не-тик оптимизированная пропускная способность передачи. Выберите вкладку списка выбора.
Нажмите на импорт. И выберите DNA_Picklist_CSV файл. Затем нажмите на игру и сохраните протокол.
Нажмите на имитацию, чтобы выполнить моделирование диспенсаций программы, чтобы убедиться, что список выбирает ожидаемый экспериментальный дизайн. Нажмите на кнопку запуска и запустите программу дозирования. Когда его спросили, вставьте запрошенную номерную пластину источника.
А потом тарелка назначения в NanoDispenser. Для настройки диспенсации трансфекционного реагента, работа в кабинете биобезопасности, чтобы разбавить липопейплекс трансфиционный реагент в сыворотке свободной среды до одного х окончательной концентрации и вихрь трубки. Немедленно обойтись до TR смесь в соответствии с предопределенным источником пластины соизволил макроса и с помощью предварительно откалиброванных 384 хорошо трубопроводов руководство приложения.
После дозирования TR выполните обследование для управления загруженными объемами TR, как это было сделано ранее для загруженной ДНК. Выберите трансфектную реакцию смеси предварительно заполненных скважин для анализа. И нажмите на кнопку "Вперед".
Убедитесь, что измеренные объемы соответствуют ожидаемым. И обеспечить, чтобы ни одна скважина не была загружена объемом более 12 микролитров. Теперь выполните сброс списка ДНК в программном обеспечении picklist.
Убедитесь, что параметры устройства по-прежнему настроены на aqueous буферов. Введите правильный источник и типы пластин назначения. На вкладке список выбора нажмите на сброс, чтобы очистить список образцов.
Затем нажмите на импорт и выберите TR_Picklist. CsV файл. Нажмите на игру.
Сохранить протокол, если предложено и выполнить моделирование программы трансфекции реагентов смеси диспенсации для обеспечения надлежащего дизайна, нажав на кнопку имитации. Как это было сделано ранее, после нажатия на кнопку запуска и запуска программы дозирования место исходной пластины, а затем пункт назначения пластины в NanoDipsenser по запросу. Чтобы обойтись без клеток, заполните новый стерильный сосуд с подготовленной клеточной подвеской и перемешайте его, чтобы избежать осадков, ведущих к неточности и плотности клеток.
Вставьте организатора трубки в раствор. Затем нажмите кнопку "премьер" до тех пор, пока подвеска ячейки не начнет смываться с распределительной головки. Убедитесь, что наконечник не засоряется, визуально осматривая поток из распределительной головы во время промывки и убедитесь, что каждая трубка загружается с подвеской ячейки.
Теперь загрузите ДНК и TR заполнены 384 хорошо назначения пластины на перистальтической жидкости обработчик пластины перевозчика и удалить его крышку. Запустите предварительно откалиброванную программу для распределения 40 микролитров подвески ячейки на полной пластине 384 хорошо. Время раздачи составляет около 45 секунд.
Наконец, замените крышку пластины 384 хорошо. Трансфекция клеток HeLa с использованием липополиплексного реагента была успешной. Количество ДНК в диапазоне от пяти до 30 нанограммов показало такую же эффективность и до 90% клеточной трансфекции при одном объеме разбавления микролитора.
В отличие от этого, более высокие количества привели к резкому снижению процента трансфектных клеток. Были протестированы различные объемы разбавляя, начиная от 15 нанолитров до четырех микролитров, и один микролитер был определен как наилучшее состояние. Для дальнейшего повышения пропускной способности этого протокола были протестированы два эффективных метода хранения ДНК, а именно сухое хранение пластины или замороженное хранилище.
Оба метода хранения не привели к значительно иным результатам, чем свежеотдаженное решение ДНК, хранящееся до семи дней. Поскольку плазменная трансфекция обычно использует по крайней мере две различные плазмиды, способность мультиплексирования ДНК этого протокола была исследована с использованием наилучших выявленных условий. Ранее использованный tdTomato красный флуоресцентный белок, выражаюющий плазмид, был модифицирован, чтобы выразить mVenus ярко-желтый флуоресцентный белок, и оба были затем использованы в попытках котрансфицирования.
Красный или зеленый флуоресцентный положительный анализ клеток показал, что эффективность трансфекции составляет около 80%, Однако, почти 100% красных клеток были также cotransfected с mVenus выражая плазмид, как можно увидеть в репрезентативном анализе изображений на основе программного обеспечения. После того, как ДНК были обойтись в источник пластины. Выполните обследование, чтобы убедиться, что ожидаемые объемы были загружены и не превышают 12 микролитров.
При дозировании реагента трансфекции в источнике пластины, старайтесь избегать пузырьков, как центрифугирование суб пластин приведет к полной потере эффективности трансфекции. Этот метод может быть применен к биологическим экспериментам, преступлениям и трансфекции и подходит в основном для того, что может быть выполнено в формате пластины 384 хорошо. Полная защитная трансфекция прокладывает путь для новых приложений, таких как плазмида, основанная на более четких литых непроверяемых подходах, позволяющих контролировать прерывистое воздействие, которое в настоящее время не может быть отсортировано в плохих стратегиях.
