Прибрежные и морские экосистемы имеют важное значение в качестве водохранилищ для удаления нитратов из наземных экосистем. Нитрат в водной среде может потребляться несколькими процессами одновременно. Такие как денитрификация, анаммокс и ДНР.
Хотя предыдущие исследования показали, что DNRA потенциально виновны в денитрификации, исследования измерения активности DNRA, как еще очень ограничено по сравнению с теми, измерения denitrification. В нашем протоколе мы предоставляем подробную процедуру измерения потенциальной скорости DNRA в экологических пробах. Мы считаем, что потенциальная ставка DNRA может быть рассчитана из N15 помечены накопление аммония с N15 помечены Нитрат дополнение.
Преимущество нашего метода по сравнению с другими методами, заключается в том, что аммоний в конечном счете преобразуется в закись азота, которая имеет низкий атмосферный фон. Также неразумно измерять закись азота с помощью четырехугольного газового хроматографа. Что дешевле и легче в управлении, чем изотоп-коэффициент масс-спектрометра.
Во-первых, поместите 60-миллиметровый кусок ленты PTFE на небольшой лист алюминиевой фольги. Пепел фильтр стеклянного волокна при 450 градусов по Цельсию в течение четырех часов в муфл печи. Затем поместите фильтр стеклянного волокна немного выше средней точки более длинной оси ленты.
Далее, пятно 20 микролитров 0,9 молей на литр серной кислоты в центре фильтра стекловолокна, и сразу же сложить ленту PTFE с помощью плоской закончился штамп и прямой закончился пинцетом. Переверните ленту PTFE над фильтром из стекловолокна, затем запечатайте обе стороны ленты PTFE, сложив, а затем плотно прижимая край пинцетом. Используя пинцет, сложите открытый конец ленты PTFE и нажмите на край.
Печать открытый конец ленты PTFE, плотно нажав на край с пинцетом, заботясь, чтобы не нажать фильтр стекловолокна. Перенесите 30 миллиграммов оксида магния в 20 миллилитров стеклянного флакона и поместите конверт PTFE во флакон. Перенесите пять миллилитров ранее подготовленного образца или стандарта во флакон, содержащий оксид магния и конверт PTFE.
И немедленно закройте флакон серой бутиловой резиновой пробкой. Затем запечатай флакон алюминиевой крышкой. Встряхните флаконы при 150 об/мин в течение трех часов при четырех градусах цельсия в темных условиях.
После этого снимите алюминиевую крышку и бутиловую резиновую пробку с каждого флакона. Удалите конверт PTFE с каждого флакона с помощью тока закончился пинцетом, и тщательно промыть конверт и пинцет с ионом обменялись водой. Затем протрите конверт и пинцет с вытирая бумагу, и поместите конверт на свежей вытирая бумагу.
Откройте конверт PTFE с плоским закончился и указал закончился пинцетом в обратном порядке складывающихся шагов. Используя плоский конец пинцета, удерживайте периферическую область фильтра стекловолокна, где серная кислота должна быть неабсорбирована. И перенесите его в 11-миллиметровую пробирку.
Промыть пинцетом с ионой обменянные воды и протрите их вытирая бумагу. Добавьте один миллилитр ионные воды в каждую пробирку. Закройте пробирки с PTFE выстроились винт шапки, и позволяют им стоять, по крайней мере 30 минут при комнатной температуре, чтобы полностью ускользнуть от аммония катиона из фильтра стекловолокна.
После этого откройте крышку винта, добавьте два миллилитров ранее подготовленного персульфата окислительного раствора реагента в пробирку, и плотно закройте трубку винтовой крышкой, чтобы предотвратить любые потери или загрязнения во время следующих шагов. Стенд пробирки на стойке, оберните их в двухслойной алюминиевой фольги, и автоклав их в вертикальном положении в течение одного часа при 121 градусов по Цельсию. Смешайте 100 миллилитров стерильных 40 миллимолей на литр фосфатного буфера и 100 миллилитров стерильных 30 миллимолей на литр глюкозы асептически.
Добавьте запас глицерола P.chlororaphis в 200 миллилитров фосфатного буферного раствора глюкозы в колбе 300 миллилитров Erlenmeyer. И очистить с ультра чистый поток гелия в течение одного часа. Затем раздай два миллилитров предварительно подготовленной подвески денитрификатора на пять миллилитровых флаконов.
Крышка каждого флакона с серой бутиловой резиновой пробкой и алюминиевым замыканием. Замените воздух Headspace ультра чистым гелием, пылесосив в течение трех минут и заряжая гелий в течение одной минуты. Установите положительное давление газа Headspace до 1,3 атмосферы, чтобы избежать непреднамеренного загрязнения воздуха.
Ввимите один миллилитр образца или стандарта через пробку бутиловой резины, используя одноразовый шприц с одним миллилитром. Затем инкубировать флаконы на ночь при 25 градусах по Цельсию, в темных условиях. На следующий день ввините 0,3 миллилитров шести родинок на литр гидроксида натрия, чтобы остановить денитрификацию и поглотить углекислый газ Headspace, который в противном случае будет нарушать анализ закиси азота.
Потому что углекислый газ и закись азота имеют одинаковый молекулярный вес. Определите количество закиси азота с молекулярным весом 44, 45 и 46 в Газе Headspace с помощью четырехугольного GC/MS с модифицированным портом впрыска. Репрезентативные результаты были получены в результате 15 экспериментов по отслеживанию азота соляных болотных отложений, созданных в результате Великого восточно-японского землетрясения 2011 года в районе Луны города Кесеннума и префектуры Мияги, Япония.
Увеличение концентрации аммония на протяжении инкубационного периода наблюдалось во всех отложениях, собранных в подтидальных и межтидальных зонах. Тарифы DNRA находились в пределах от 24,8 до 177. И сопоставимы с значениями, зарегистрированными в предыдущих исследованиях, но выше значений, полученных из аналогичных сред.
Высокий уровень DNRA, может быть объяснено солончак используется в качестве поля выращивания до землетрясения. В соответствии с спекуляциями, скорость DNRA в межтидальной зоне, которая является богатым и органических соединений по сравнению с субтидальной зоны, был выше. Наш протокол широко применим к анализу метаболических путей, который включает в себя образование аммония и N15 следов дополнений.
