Этот протокол может быть использован для создания не случайной модели мыши для тестирования и количественной оценки реактивации неактивной X-связанной хромосомы Mecp2 в мозге живой мыши. Эта модель может быть легко изменена для изучения реактивации Xi в других моделях болезней, связанных с X, таких как синдром DDX3X. Я пост документ в лаборатории Санчита Бхатнагар, и я буду демонстрировать процедуру с Земинг Чжэн.
Начните с позиционирования анестезированной мыши в стереотаксической платформе с резцами, зацепленными в баре укуса ревербератора морды. Затяните зажим носа, сохраняя при этом голову мыши на плоскости уровня. Отрегулируйте высоту баров уха, чтобы достичь хвостовой части ушного канала, чтобы держать голову обездвиженным.
Затем дезинфицировать голову чередующимися салфетками местного антисептика и 70%этанола. Когда мышь будет готова, используйте стерильный скальпель, чтобы сделать 0,75 сантиметра горизонтального разреза в середине кожи головы. Используйте заусенец диаметром 0,45 миллиметра для бурения двух симметричных отверстий над правым и левым корковым полушариями в двух миллиметрах от сагиттального шва и шва ягненка в приблизительной середине теменной кости.
Твердо прикрепите 10 микролитровый шприц к стереотаксической платформе и загрузите в шприц 10 микролитров свежеприготовленного химического ингибитора. Заранее иглы в первое отверстие заусенцев, сохраняя при этом иглу перпендикулярно черепу. Когда игла пересекает череп, обнуляет координаты на стереотаксическом цифровом дисплее и заранее кончик иглы, пока она не достигнет глубины 2,5 миллиметра.
Свяжете иглу 0,5 миллиметра на глубину двух миллиметров и медленно ввелите весь 10 микролитровый объем раствора в течение одной минуты. После того, как все ингибитор был доставлен, оставить иглу в мозг еще на минуту, прежде чем снять иглу. Повторите инъекцию во второе отверстие заусенцев, используя транспортное средство только в качестве контроля и закрыть кожу над разрезом.
Затем перенесите мышь из стереотаксического аппарата на 37-градусную грелку Цельсия с мониторингом до полного выздоровления. В конце режима дозы закрените мышь на вскрытой площадке. Используйте ножницы и типсы, чтобы сделать боковой разрез через интеграмент и брюшную стенку прямо под грудной клеткой.
Тщательно отделить печень от диафрагмы и прорезать диафрагму по всей длине грудной клетки, чтобы разоблачить плевральной полости. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез на задний конец левого желудочка и немедленно ввести правую камеру сердца с примерно 15 миллилитров PBS в течение двух минут. Успешная перфузия приведет к изменению цвета печени с красного на бледно-розовый.
Когда все PBS был доставлен, perfuse сердце с примерно 10 миллилитров 4%paraformaldehyde в PBS в течение двух минут. После сбора головы, используйте ножницы, чтобы сделать разрез средней линии кожи головы, чтобы разоблачить череп. Поместите один кончик ножниц в foramen magnum, чтобы облегчить создание бокового разреза в черепе к глазу.
Сделайте аналогичный разрез на другой стороне черепа, сохраняя конец ножниц как можно более поверхностным и сократить область черепа между глазами и над носом мыши. Используйте типсы, чтобы аккуратно очистить черепные кости от полушарий мозга и использовать шпатель, чтобы поднять мозг. Тщательно вскрыть черепных нервных волокон, которые фиксируют мозг черепа и поместить мозг в пластиковую тарелку.
Затем акциз мозжечка и обонятельные луковицы. Чтобы получить участки ткани мозга, сначала исправить мозг в 15 миллилитров трубки заполнены 4%paraformaldehyde в PBS при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующее утро, промыть ткани мозга по крайней мере три раза в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию в свежем PBS за стирку.
После последней стирки снимите переднюю часть каждого полушария ножницами и типсами и поместите образцы в помеченные крио-формы спереди вниз. Погрузите каждую ткань в оптимальную температурную среду резки перед тем, как заморозить образцы жидкого азота в 10-миллиметровой пластиковой чашке Петри при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы определить реактивацию Си, погрузите пять-шесть секций ткани мозга в раствор для поиска антигенов в течение пяти минут на тепловом блоке 100 градусов по Цельсию.
В конце инкубации, мыть горки с четырьмя пятиминутными моет при комнатной температуре со свежим PBS за стирку, прежде чем погрузить слайды в блокирующий раствор. После 20 минут при комнатной температуре, мыть горки три раза в течение пяти минут в свежем буфере мытья за стирку. Пятно образцов тканей с соответствующими первичными антителами при четырех градусах цельсия в одночасье.
Изображение слайдов на флуоресценции микроскопа регулировки контрастности и яркости, чтобы количественное количество GFP положительных клеток для наркотиков и транспортных средств лечение мыши полушарий мозга. Чтобы продемонстрировать осуществимость не случайной модели инактивации Х-хромосомы мыши для неактивных исследований реактивации Х-хромосомы, генотипы женского трансгенного эмбрионального фибробласта мыши были подтверждены генотипирующей ПЦР и цитометрией потока. По оценке ПЦР, экспрессия GFP помечены метилен CPG связывания белка два гена или MECP2 был активирован наркотиков, но не лечение транспортных средств.
Не случайные Х-хромосомы инактивации мыши модели эмбриональных фибробластов также выразил ядерной GFP после наркотиков, но не лечение транспортного средства, демонстрирующие ингибиторы фактора инактивации Х-хромосомы реактивировать инактивированные Х-хромосомы связаны MECP2 в мыши эмбриональных фибробластов. Лекарственное лечение активизирует инактивированную Х-хромосому MECP2-GFP примерно в 30% клеток в полушариях мозга, пропитанных наркотиками, в то время как в полушариях, пропитанных транспортным средством, реактивация не обнаруживается. Microtubule-ассоциированный белок два положительных нейронов также GFP положительный в обработанных препаратом полушариях свидетельствует о инактивированной Х-хромосомы MECP2-GFP выражение.
Режим препарата будет зависеть от цели и эффективности малых ингибиторов молекулы так оптимизировать дозу и лечение в пробирке перед тестированием in vivo. Неугадная модель мыши может быть использована для тестирования различных препаратов как индивидуально, так и в комбинации. В самом деле, мы и другие определили несколько наркотических Х-хромосомы инактивации факторов.
