Хотя масштабирование является одним из универсальных и основополагающих атрибутов систем развития, основные механизмы не были поняты во многих органах и тканях. Техника уменьшения размера зебры, представленная в этом видео, будет способствовать вашему пониманию механизмов, лежащих в основе динамических процессов масштабирования. Преимущества работы с зебрами в том, что легко выполнять живую визуализацию, генетику и количественный анализ.
Наша техника также очень проста и проста в применении без какого-либо специализированного оборудования или интенсивного обучения. Здоровье эмбрионов является ключом к успеху с этой техникой. Используйте молодую рыбу в качестве родителей и будьте осторожны, чтобы свести к минимуму ущерб, удалив хорионы.
А также играть вокруг в размере раны на желток, и сколько клеток удаляются. Поскольку эмбрионы, которые мы используем, очень молоды и хрупки, с ими нужно обращаться очень осторожно при переносе и измельчении. В то же время, она должна быть быстрой, чтобы процедура можно было сделать в нужное время окно развития.
Визуальная демонстрация может дать хорошее представление о том, как производить меньшие эмбрионы эффективно. Чтобы сделать проволочную петлю для измельчения эмбрионов, кормить 20 сантиметров в длину жесткой и некоррозионной проволоки из нержавеющей стали через стеклянную капиллярную, что делает небольшой, один миллиметр длиной петли в верхней части. Поместите немного капли ясного лака для ногтей на кончике класса капилляров, между капиллярной и проволочной петли, чтобы держать его на месте, убедившись, что не получить лак для ногтей на петлю часть, так как это может повредить эмбрионы.
А потом дайте ему высохнуть. Используйте лабораторную ленту, чтобы прикрепить стеклянную капиллярную ленту с петлей на деревянную палочку, оставляя около двух с половиной сантиметров стеклянной капиллярной, простирающейся за пределы палочки для еды, чтобы часть палочки для еды инструмента не окунается в воду позже. В 100-миллиметровой стеклянной чашке Петри с пластиковым шпателем, распространение примерно 0,5 миллилитров 2%метил целлюлозы вблизи центра дна тонко и равномерно толщиной около 0,5 миллиметра.
Налейте около 30 миллилитров раствора Ringer в сторону блюда, и дайте ему распространиться на остальную часть блюда и покрыть метил целлюлозы. Поместите ранее де-хорионированных эмбрионов на 256 клеток до одной стадии K клеток на 2%метил целлюлозы, убедившись, что эмбрионы ориентированы на их стороне. Чтобы нарезать бладулу, используйте проволочную петлю, чтобы сократить вблизи полюса животного, перпендикулярно вегетативной оси животных и отрубить примерно от 30 до 40% бластодермных клеток.
Затем аккуратно нажмите концы вместе, чтобы помочь остальным клеткам придерживаться обратно. Для желтка, использовать установленный провод, чтобы сделать небольшую рану возле вегетативного полюса, nicking яичной мембраны, которая приведет к желток ил в течение нескольких минут, а затем исцелить. Когда желток перестает сочиться, используйте пипетку, чтобы переместить эмбрион за пределы метил-целлюлозы в том же блюде для восстановления.
Повторите бластулу и желток измельчения для всех эмбрионов, а затем оставить блюдо спокойно в течение 30 минут, пока эмбрионы восстановить. Затем используйте стеклянную пипету для переноса эмбрионов в ранее приготовленную 35-миллиметровую стеклянную тарелку, содержащую свежий раствор Ringer, и поместите их в инкубатор по Цельсию на 28,5 градуса цельсия, чтобы обеспечить полное восстановление перед тем, как продолжить визуализацию. После выполнения двух этапов измельчения с бласулой и желтком, эмбрионы показали, казалось бы, нормальную общую морфологию на протяжении всех стадий развития по сравнению с контрольными эмбрионами, кроме разницы в размерах.
С другой стороны, только рубленые эмбрионы показали своеобразную морфологию, особенно на ранних стадиях. Во время эпиболии эмбрионы имели суженный и отступный вид. На следующей стадии сомитов были обнаружены сплющенные структуры средней линии на многих осяхных уровнях.
На более поздних стадиях структуры тела, прилегающие к желтку, такие как середина и задний мозг, по-прежнему проявляли относительно уплощенной формы, возможно, из-за повышенного напряжения от относительно большего желтка. Промежуток времени изображения формирования сомита показали, что как в контроле, так и в нарезанных эмбрионах, размеры сомитов, которые были сформированы на более поздних стадиях, были меньше по сравнению с теми, которые были на более ранних стадиях. Кроме того, на протяжении всех стадий формирования сомитов, нарезанные эмбрионы имели меньшие сомиты, чем те, которые контролируют эмбрионы.
Когда два шага измельчения техника была выполнена на мембране mCherry вводили эмбрионы, изображения их спинного мозга на 20 часов после оплодотворения показали снижение высот нервной трубки из-за уменьшения размера. Два шага измельчения очень важно, чтобы получить меньше, но в противном случае нормальные эмбрионы с высокой эффективностью. Важно помнить, чтобы не нарезать желток при отрублении клеток от бласулы.
Для желтка, сделать крошечные раны на нем для содержания ил из. И желтковая мембрана заживет естественным путем в надлежащем буфере. Поскольку измельченные эмбрионы могут быть быстро восстановлены, любые методы или анализ могут быть применены к нормальным эмбрионам могут быть выполнены после метода уменьшения размера.
Простота и универсальность этого метода является очень мощным, как кто-нибудь может ввести этот метод для изучения проблемы масштабирования в любой ткани или органа в зебры. Мы считаем, что с помощью этой техники исследователи могут решать проблемы масштабирования в различных системах, которые были нетронутыми раньше. Мы уже сделали важные открытия в масштабировании узора сомитов и нейронных труб.
