Этот протокол демонстрирует новую процедуру последовательного иммунофторесценции и иммуногистохимии на криосекциях с ранней стадии эмбройс-зебры, которая позволяет проводить точные анализы совместной локализации в конкретных популяциях клеток. Основным преимуществом этого протокола является гибкость. Он сочетает в себе иммунофторесценцию и иммуногистохимию методов с использованием одной криозации для максимизации морфологии тканей, совместной локализации экспрессии и совместимости антител.
Этот протокол может быть применен к другим рыбам или амфибии модели, как эти исследователи часто сталкиваются с аналогичными осложнениями с наличием антител и часто выполняют аналогичные типы экспериментов. Работа с ранней стадии криозирования эмбрионов может быть сложно, поскольку они малы и криозирование может быть сложной задачей, но передовая подготовка и практика поможет облегчить любую борьбу в этом методе. Есть несколько шагов в нашем протоколе, которые требуют особой обработки и ухода и может быть трудно освоить, не видя, кто-то продемонстрировать методы.
Для начала, передача предыдущих фиксированных и подготовленных сорок восемь часов после оплодотворения химерных эмбрионов зебры из трубки с 15 25 OCT смеси пластиковой формы с использованием тибры минимизации любой передачи смеси. Заполните форму примерно наполовину со средой OCT и аккуратно смешайте эмбрионы в ней. Подготовка помечены пластиковые формы и передачи желаемых эмбрионов в пустые помечены пластиковые формы, сводя к минимуму перенос OCT среды.
Затем аккуратно заполните ОКТ среды в верхней части формы с эмбрионами. Работая под световым стерео микроскопом для визуализации, используйте иглы для организации эмбрионов в нужной ориентации. Затем поместите подготовленные формы в изолированный контейнер с металлической платформой и заморозьте их на сухом льду.
Поместите ведро со льдом мягко над металлической платформой, чтобы создать холодную камеру и заморозить в течение примерно 30 минут. Используя криостат, установленный при температуре минус 20 градусов по Цельсию, вырезать встроенные эмбрионы в 10 до 12 микрометров толщиной cryosections при проверке глубины раздела периодически на микроскоп для мониторинга местоположения и ткани. Поместите секции на заряженные стеклянные горки и высушите их при комнатной температуре на ночь.
Вымойте слайды три раза в течение пяти минут в 1X PBS в соответствующем контейнере. Положите горки на плоскую поверхность во влажной камере. Используйте барьерную ручку, чтобы наметить разделы, чтобы сохранить жидкость на слайдах.
Pipette 200 микролитров блока буфера на секцию и инкубировать в буфере блока в течение двух часов при комнатной температуре. Подготовка первичного разбавления антител и блокировать буфер и хорошо перемешать с помощью пипетки. Аккуратно наконечник слайды слить буфер блока и вернуться во влажную камеру.
Pipette 200 микролитров первичного раствора антител на секцию на слайдах и 200 микролитров буфера блока на соответствующие разделы в качестве контроля. Инкубировать слайды при четырех градусах по Цельсию на ночь во влажной камере, наполненной деионизированной водой убедившись, чтобы запечатать края камеры, чтобы помочь сохранить влагу. Вымойте слайды три раза в течение пяти минут в 1X PBS и в соответствующем контейнере.
Подготовка вторичного разбавления антител во время стирки и блок буфера и хорошо перемешать путем пипетки. После укладки слайдов на плоскую поверхность во влажную камеру добавьте 200 микролитров вторичного раствора антител на секцию. Инкубировать слайды в вторичном растворе антител при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
Вымойте слайды три раза в течение пяти минут в 1X PBS в соответствующем контейнере. После размещения слайдов на плоской поверхности, добавить ядерный раствор окрашивания на каждой секции и инкубировать покрыты в течение 10 минут. После слива ядерного раствора окрашивания, смонтировать слайды с не-затвердевания флуоресцентных монтажных средств и стеклянной крышкой скольжения.
Убедившись, чтобы держать их в темноте при четырех градусах по Цельсию до визуализации. Поместите слайды в отдельных контейнерах с 1X PBS и хранить плоские при четырех градусах по Цельсию на ночь, в то время как осторожно агитирует, чтобы ослабить крышку скользит достаточно, чтобы они будут отключаться, когда взволнован. Убедитесь в том, чтобы не давить на крышку скольжения или попытаться удалить крышку скольжения вручную, но ждать, пока они отходят с минимальными принудительного движения.
После того, как крышка скользит были удалены, осторожно передать слайды в контейнер со свежим 1X PBS. Удалите 1X PBS и инкубировать слайды в 1X три-буферный солевой раствор с 0,1% неионных сурфактант три раза в течение пяти минут при комнатной температуре. Инкубировать слайды в 3%перекиси водорода раствор при комнатной температуре в течение 15 минут.
Затем положите слайд плоским и добавить блок буфера падение мудрым на поверхность. Аккуратно наконечник слайдов слейте буфер блока. Высушите область вокруг секций и поместите горки во влажную камеру.
Добавьте 200 микролитров раствора первичного антитела на секцию на слайды и инкубировать во влажной камере при четырех градусах Цельсия за одну ночь. Аккуратно наконечник слайды слить первичный раствор антитела и мыть два раза в течение пяти минут в 1X TBST. Затем нанесите готовый к использованию фон снижения блокирующих реагентов падение мудрым для каждого раздела, и инкубировать во влажной камере при комнатной температуре в течение 20 минут.
Аккуратно наконечник слайдов слейте буфер блока. Тщательно высушите область вокруг секций и поместите горки плоскими во влажную камеру. Применить готовый к использованию вторичный раствор антитела для каждого раздела падение мудрым и инкубировать во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут.
Аккуратно наконечник слайды слить вторичного раствора антитела и мыть два раза в течение пяти минут в 1X TBST. После высыхания области вокруг секций, поместите слайды на плоскую поверхность и добавить 200 микролитров хромогенного субстрата HRP к каждому разделу. Запустите таймер, когда субстрат был применен к первому слайду и инкубировать при комнатной температуре в течение трех минут.
Слейте с субстрата раствор. Промыть горки кратко в соответствующем контейнере с 1X PBS и мыть их в деионизированной воде дважды в течение пяти минут с нежным возбуждением. Counterstain слайды, поместив их в гематоксилин окрашивания раствора на срок до 30 секунд и мыть три раза в течение пяти минут каждый в деионизированной воде.
Инкубировать горки в контейнере, содержащем Tapwater Скотта в течение одной минуты, а затем мыть снова три раза в течение пяти минут в деионизированной воде. Обезвоживать слайды через ряд сортов этанола, разбавленных в деионизированной воде и ксилена в химическом капюшоне. После удаления слайдов из ксилена сразу же добавить толуол на основе монтажа среды и место крышки скольжения.
Для обеспечения успеха при скольжении крышки, важно работать с одной стороны слайда на другую, медленно опуская крышку скольжения для предотвращения пузырьков, которые бы скрыть ткани. Наконец, визуализировать и изображение слайдов с помощью соединения световой микроскоп и цифровая камера на 100X увеличение. Специфические антитела, используемые здесь для одновременного выявления размножающихся клеток и донорских клеток, идентифицируют и количественно идентифицируют донорские клетки, которые активно размножаются.
После иммунофторесценции и иммуногистохимии необходимо создавать высококачественные изображения, чтобы точно идентифицировать отдельные клетки. Для выполнения наложения изображений использовалась программа анализа изображений. При попытке этой процедуры наиболее важно адекватно пятно и счетчик пятно слайды во время иммуногистохимии.
После этой процедуры дополнительные методы могут быть выполнены в качестве модификаций к первоначальному протоколу, таких как использование различных комбинаций антител, типов тканей или видов. Изображения также могут быть проанализированы различными способами для получения соответствующих данных. Этот метод позволил нам взглянуть на колокализации и несколько генетических фонов, как способ исследования клеток к клеткам взаимодействия и могут быть применены аналогично другим методам, требующим детального анализа совместной локализации.
Многие из реагентов в иммуногистохимии являются опасными и должны рассматриваться соответствующим образом. Работа с этанолом, ксиленом и монтажной жесткой должна выполняться в капюшоне. Dab отходы должны быть утилизированы в качестве опасных отходов и после DAB моет должны быть отбеленные.
