Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии макрофагов, например, как охарактеризовать состояние активации в различных средах на уровне белка. Основным преимуществом этого метода является то, что он дает возможность получить различное выражение многих белков в макрофагах человека с помощью метода количественной оценки без этикетки. Демонстрация процедуры будет Мари Малиер и Магали суд из моей лаборатории.
Для начала добавьте 15 миллилитров раствора разделения градиентных клеток плотности в каждую из двух 50 миллилитровых центрифугированных трубок, чтобы раствор можно было прогреть до комнатной температуры перед получением LRSC. Это важно, так как плотность зависит от температуры. Опустите LRSC в 50 миллилитров центрифугации трубки.
Добавить 1x PBS до 50 миллилитров и перемешать. Затем, очень медленно, добавьте 25 миллилитров смеси поверх 15 миллилитров эквивалентного градиентного раствора плотности. Будьте осторожны, чтобы не смешивать фазы во время этого шага.
Кровь должна быть добавлена на плотность градиентного раствора без каких-либо нарушений этой фазы. Центрифуга обеих центрифугации труб в течение 25 минут при 700 G без перерывов. В конце градиентной центрифугации плотности слоями снизу вверх являются эритроциты и гранулоциты, образующие гранулы, фазу градиентного раствора плотности, слой ПХМВ и разбавленную плазму.
С пипеткой, пройти через плазменную фазу, не аспирируя его. Затем соберите слой PBMC в новую 50-миллилитровую центрифугированную трубку. Добавить до 50 миллилитров 1x PBS для ПКМК в качестве стиральной установки и центрифуги в течение 10 минут при 300 Г.Аспират супернатанта и повторно приостановить гранулы в 40 миллилитров макрофагов среды.
После установки ПМГ в малазезской камере перенесите количество ПМГ, необходимое для проведения эксперимента, в центрифугированную трубку. Центрифуга клетки в течение 10 минут при 300 Г.Аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 80 микролитров сортировки буфера на 10 миллионов ПКМК. Затем добавьте 20 микролитров микропивоварни CD14 microbeads на 10 миллионов ПКМК.
Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия при постоянном возбуждении. После инкубации добавьте один миллилитр буфера сортировки на 10 миллионов ПМГ в качестве шага для мытья и центрифуги, как раньше. Затем аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 500 микролитров сортировки буфера на 100 миллионов ПКМК.
Теперь поместите столбец в магнитное поле сепаратора. Подготовь столбец, опоясыв его тремя миллилитров буфера сортировки. Нанесите подвеску ячейки на столбец.
Затем соберите поток через содержащие неоцеличные клетки для последующего окрашивания, если это необходимо. Вымойте столбец три раза тремя миллилитров буфера сортировки. Будьте осторожны, чтобы не высушить колонку.
Затем поместите трубку сбора под колонку и удалите ее из сепаратора. После мытья, пипетка пять миллилитров сортировки буфера в колонку. Немедленно промыть магнитно помеченные клетки, твердо толкая поршень в колонку.
Наконец, повторите эти шаги с помощью новой колонки, прежде чем помыть моноциты и выработать макрофаг поляризации, как описано в текстовом протоколе. Поддерживайте моноциты и макрофаги в контролируемой кислородом среде для проведения гипоксического анализа состояния. Используйте гипоксию рабочей станции для поддержания клеток под желаемым кислородом частичное давление во время эксперимента.
При работе под низким давлением кислорода, важно подготовить все средства массовой информации и стиральные буферы под станцией, и ждать достаточно, чтобы получить правильное частичное давление в жидкости. Выполните лиз ячейки в буфере под адаптированным капюшоном. Загрузите белковый эквивалент 300 000 клеток для каждого образца на 4-12%bis-tris акриламидных гелей.
Контролйте продолжительность электрофоретической миграции, чтобы позволить каждому образцу белка разделиться на шесть полос геля, как показано здесь. После фиксации и окрашивания, как описано в текстовом протоколе, акциз белковых полос с чистым скальпелем. Нарезать кубиками каждую вырезанную полосу перед размещением их в 500 микролитровых трубок.
Теперь, мыть гель ломтиками три раза в 200 микролитров 25 миллимолярный бикарбонат аммония в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию, отбрасывая бикарбонат аммония между каждым шагом. Следуйте этому с одной стирки в 25 миллимолярия бикарбоната и ацетонитрила. Затем обезвоживать кусочки геля 200 микролитров 100%ацетонитрила в течение 10 минут.
Инкубировать каждый кусок геля с 10 миллимолярд DTT и 25 миллимолярия бикарбоната в течение 45 минут при 56 градусов по Цельсию. Затем отбросьте DTT и инкубировать гель кусок с 55 миллимолярной иодоацетамида в 25 миллимолярия бикарбоната аммония в течение 35 минут в темноте при комнатной температуре. Чтобы остановить алкиляцию, отбросьте использованный раствор и инкубировать каждый кусок геля с 200 микролитров 10 миллимолярный DTT в 25 миллимолярный бикарбонат аммония в течение 10 минут при комнатной температуре.
Вымойте кусочки геля в 200 микролитров 25 миллимолярный бикарбонат аммония. Затем обезвоживают 200 микролитров 100%ацетонитрила в течение 10 минут. Перемешайте белки на ночь при 37 градусах по Цельсию с помощью trypsin/Lys-C Mix в соответствии с инструкциями производителя.
Извлекайте полученные пептиды из кусочков геля, добавляя 50 микролитров 50%ацетонитрила в течение 15 минут в трубках с низким поглощением. После добавления 50 микролитров 5% кремовой кислоты в течение 15 минут, добавить 50 микролитров 100%ацетонитрил в течение 15 минут. Вытяните и высушите каждую фракцию в низкопоглощенных трубках, чтобы ограничить поглощение пептидов и потерю образца.
Храните образцы при 80 градусах по Цельсию до дальнейшего анализа, подробно описанного в текстовом протоколе. Здесь показана репрезентативная чистота, оцениваемая цитометрией потока после выбора магнитной шариком положительных моноцитов CD14. Фазовая контрастная визуализация дифференцированных человеческих макрофагов показывает неоднородность полученных морфологий для двух различных поляризаций после девяти дней культуры.
Показан пример переваривания вне геля с использованием окрашенных в серебро гелей SDS-страниц. Оценка белка из клеточного лиза и после пищеварения в растворе показывает отсутствие деградации во время лиза и эффективность пищеварения. Здесь показан пример столкновения индуцированного спектра диссоциации пептида, найденного при соотношении массы к заряду 597,29 на спектре MS с электрическим зарядом положительных двух.
Из этого спектра была определена соответствующая последовательность. Окончательный результат после анализа представляет собой тепловую карту, представляющую иерархическую кластеризацию всех состояний поляризации с использованием дифференцированно выраженных белков. Анализ показывает кластер белков, чрезмерно выраженных во всех поляризациях в состоянии 3%кислорода.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что вы должны решить, сначала какой фракции вы будете выполнять на новых образцах, чтобы адаптировать протокол соответствующим образом. Протеомный подход, использующий эту работу, дополняет геномные подходы, которые использовались в последние годы в области исследований поляризации макрофагов биологии. После своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователя в области иммунологии, чтобы исследовать различные состояния активации иммунных клеток у людей, а также у других млекопитающих.
Не забывайте, что работа с DTT может быть опасной, поэтому вам нужно работать под адаптированным капотом, чтобы сделать эту процедуру.
