Измерение региональных показателей синтеза белка мозга может проследить реакцию мозга на долгосрочные изменения, которые происходят во время развития и нейропластичности. Наш метод имеет преимущества, что измерения являются полностью количественными, и они сделаны в бодрствующим поведением животных. Количественная ауторадиографическая техника позволяет измерения во всех областях мозга одновременно.
Демонстрация процедуры будет Анита Торосян, после бакалавриата парень в моей лаборатории, и Тяньцзян Хуанг, наш хирург животных. Начните эту процедуру с подготовки к операции, как описано в текстовом протоколе. Оказавшись на стадии операции, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать один сантиметр разреза из верхней медиальной части левого бедра rostrally к средней линии выявления бедренной артерии и вены.
Убирать свободную кожу с хирургическими крючками кожи выше и по обе стороны от разреза. Безопасные крючки кожи, лентой их на стадии операции. Нанесите стерильный хлорид натрия на 0,9% на открытый район для поддержания достаточной влажности.
Используйте типсы, чтобы тупо вскрыть, отделяя соединительной ткани вокруг небольшой части бедренной артерии и вены. Аккуратно отделяйте артерию и вену. Теперь используйте миппы, чтобы нить одну прядь абсорбируемого шва под бедренной вены и артерии в самой боковой точке разреза.
Потяните шов на полпути через так концы даже. В более проксимальной точке паха, использовать миппы, чтобы нить второй шов только под бедренной вены. Аккуратно свяжите половину узла, который будет использоваться для ограничения кровотока.
В точке между нитью А и нитью B используйте миппы для резьбы третьего шва только под бедренной вены. Аккуратно завяжу полный узел, который будет использоваться для ограничения кровотока. Будьте осторожны, чтобы не разорвать вену.
Аккуратно буксир на прядь B, чтобы ограничить кровоток. Используйте гемостат, чтобы аккуратно буксир прядь B для поддержания ограничения крови. Теперь соедините неразрезаемый конец трубки PE с иглой 32 калибра и шприцем диаметром один миллиметр, наполненным гепаринизированным солевым раствором.
Промыть катетер, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вырезать небольшое отверстие в ограниченной области бедренной вены с микро ножницами, и тщательно вставить угловой конец покраснел PE восемь труб к нити B.Once вставлены, отпустите напряжение нити B и направлять катетер дальше вверх по вене. Затяните прядь B вокруг вены, содержащей катетер.
Используя прядь C, завяжете дополнительный узел вокруг катетера. Убедитесь, что этот узел не захватывает бедренную артерию. Аккуратно отступить на шприц баррель частично заполнить трубки с кровью, чтобы убедиться, что катетер был имплантирован должным образом, прежде чем вставить PE 10 катетер в левую бедренную артерию с помощью той же процедуры.
После того, как бедренной вены и артерии катетеры были обеспечены, галстук прядь в узел вокруг обоих катетеров. После резки всех лишних швов и удаления крючков кожи, промыть артериальный катетер с гепаринизированным солевым раствором, чтобы предотвратить свертывание крови. Прижигайте концы обоих катетеров, чтобы создать уплотнение.
Поместите мышь в положение склонных и сделать небольшой разрез в основании шеи применения солевого раствора в открытой области. Вставьте полый металлический стержень поддермально от разреза шеи до бедренной кости. Змея катетеры через полый стержень и из шеи разрез.
После удаления полого стержня, закройте бедренной разрез с швом следуют послеоперационной анальгезии. Змея катетеры через 30 сантиметров гибкой полой трубки, чтобы сделать весенний трос, прежде чем зашить кнопку весеннего троса под кожей следуют послеоперационные анальгезии. Переместите мышь в четкий цилиндрический контейнер с поворотным креплением и рукой для дома мыши в период восстановления.
Поместите руку теплее под контейнер, чтобы держать мышь теплой. Убедитесь, что мышь находится в нормальном физиологическом состоянии в начале эксперимента, взяв образцы, как описано в текстовом протоколе. Для внутривенного введения трассировщика используйте Y-разъем со шприцем, держащим трассировщик С 14 с маркировкой лейцина, подключенный к одной руке, и шприц со 100-200 микролитров стерильного солевого раствора, чтобы промыть венозную линию, соединенную с другой рукой.
Подключите Y-разъем к венозной линии. Инициировать исследование, одновременно начиная стоп-часы, инъекционные трассировщик, и сбор сроков образцы артериальной крови. Промыть венозную линию солевым раствором сразу после инъекции.
Сбор образцов крови от одного до семи непрерывно в течение первых двух минут эксперимента таким же образом. Собрав семь образцов, соберите 30 микролитров мертвой космической крови перед каждым оставшимся образцом. Образцы от 8 до 14 собираются в три, пять, 10, 15, 30, 45 и 60 минут соответственно.
В какой-то момент в ходе эксперимента, процесс три трубки для внутренних стандартов, содержащих тритиированный лейцин и норлеуцин, как подробно описано в текстовом протоколе. Для количественной оценки концентраций плазменного лейцина используйте систему HPLC с колонкой обмена катиона натрия и выводом столба с ортофталальдегидом и мукометрическим обнаружением. Область под кривой лейцина пропорциональна концентрации лейцина в образце.
Используйте сравнение со стандартами для количественной оценки концентраций лейцина в образцах. Затем используйте счетчик жидких сцинтилляций для количественной оценки распада в минуту трития и С 14 в образцах плазмы. Используйте эти концентрации для построения кривой зазора C 14 помечены лейцин из циркуляции и время его специфической активности в артериальной плазме.
На графике вычислить интегрированную C 14 помечены лейцина конкретной активности в артериальной плазме. Для выполнения количественной ауторадиографии подготовьем секции мозга толщиной 20 микрон. Раздел мозга с помощью криостата при минус 20 градусах по Цельсию.
Оттепель монтировать разделы на желатин покрытием слайдов. После фиксации слайдов, организовать слайды в рентгеновской кассете пленки вместе с набором ранее откалиброванных C 14 помечены метил-метакрилат стандартов. В темной комнате и под безопасным светом, поместите кусок рентгеновской пленки, эмульсии стороны вниз по бокам и стандартам.
Печать кассеты и поместите его в черный мешок смены. Разработка пленок в соответствии с инструкциями производителя. Автоматизированная разработка пленки не рекомендуется, поскольку фон может быть неравномерным и может повлиять на количественную оценку.
Создайте кривую калибровки оптической плотности по сравнению с концентрацией ткани C 14 на основе оптических значений плотности набора откалиброванных стандартов на пленке. Приготовь эти данные к полиномианному уравнению. Либо второй или третьей степени полиномиальное уравнение подходит очень хорошо.
Чтобы проанализировать конкретные области мозга, найдите область интереса или рентабельность инвестиций в шести-восьми разделах по сравнению с атласом мозга. Запись оптической плотности пикселей в пределах рентабельности инвестиций во всех разделах. Основываясь на кривой калибровки, вычислите концентрацию ткани C 14 в каждом пикселе.
Наконец, вычислить региональные темпы синтеза церебрального белка из средней концентрации ткани C 14 в рентабельности инвестиций в интеграл соотношения концентраций артериальной плазмы неоцеличных и помеченных лейцина в разы т и баранины. Доля лейцина в бассейне прекурсоров тканей, который исходит от плазмы. Здесь показаны репрезентативные изображения из автомобиля обработанного животного по сравнению с животным, обработанным анисомицином, ингибитором синтеза белка.
Скорость синтеза белка пропорциональна уровню темноты на изображении. Анисомицин резко снижает измеренные темпы синтеза белка мозга, указывающие на специфику этого метода. Здесь, оцифрованные авторадиограммы показаны от бодрствуя ведя мыши на уровне гиппокампа и hypothalamus.
Темные области имеют более высокие региональные показатели синтеза церебрального белка. Здесь показана оцифрованная авторадиограмма от бодрствующим мышью управления поведением на уровне спинного гиппокампа. Скорость синтеза церебрального белка по цвету покрыта изображениями в соответствии с цветовой гаммой.
При попытке этой процедуры, важно быть уверенным, что животные находятся в нормальном физиологическом состоянии во время измерений. Наша методология уже продемонстрировала дисрегуляцию синтеза белка при нейроразвитиях, таких как синдром Хрупкой Х. Он также может быть полезным маркером для дегенеративных изменений и условий, таких как болезнь Альцгеймера.
Метод синтеза белка может быть использован в сочетании с иммунной гистохимией в чередующихся секциях для корреляции изменений в синтезе белков с региональными изменениями в конкретных белках. Таким образом, количественный ауторадиографический метод L-1 C 14 лейцина идеально подходит для точного определения региональных темпов синтеза белка in vivo. Он предлагает значительные преимущества с точки зрения точности и его применимости к условиям in vivo.
