Микрофлюидные устройства, используемые для разобщенности нейронов, стали стандартным инструментом в неврологии, что позволяет исследователям физически и химически манипулировать субклеточными областями нейронов, включая соматы, аксоны, дендриты и синапсы. Эти разрозненные устройства культуры могут помочь ответить на многочисленные вопросы в области неврологии, такие как, как аксоны распространяются во время развития, чтобы сформировать синапсы, как синапсы переделывать и реформировать после повреждения аксона и как патологические условия могут транс-синаптически размножаться при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера. Этот протокол описывает использование предварительно собранного пластикового многокомпоненциального чипа для разобщенности культуры первичных крысиных нейронов.
Основным преимуществом использования этих чипов является то, что они обеспечивают простой в использовании и очень воспроизводимый метод разобщенить нейроны. Еще одним преимуществом является то, что эти чипы дают более здоровый, долгосрочный рост нейронов и изолированных аксонов, чем предыдущие кремниевые разрозненные устройства и в равной степени совместимы с микроскопией высокого разрешения. Другие модельные системы, включая стволовые клетки человека, также могут быть обучаемы в предварительно собранном разрознять чип.
Для начала поместите стерильный многокомпоненциальную фишку в чашку Петри. Добавьте 100 микролитров предкодирования раствора в верхнюю левую колодец чипа и дайте ему протекать через основной канал в прилегающую колодец. Далее заполните нижний левый колодец чипа 100 микролитров предкодирования раствора.
На этот раз подождите пять минут, чтобы раствор протек через микро-грувы. Теперь добавьте 100 микролитров предкодного раствора в верхнюю правую колодец и дайте ему протекать через основной канал в соседний колодец. Через 90 секунд заполните нижний правый колодец 100 микролитров раствора прекодирования и инкубировать чип в течение 10 минут.
Тщательно угол наконечник пипетки, от основного канала и аспирировать решение из каждой хорошо. Затем немедленно добавьте 150 микролитров PBS в верхний левый колодец и подождите полтора минуты. Затем добавьте 150 микролитров PBS к левому нижнему левому колодец и подождите пять минут, чтобы жидкость текла через микро-канавки.
Затем добавьте 150 микролитров PBS в верхние правые и нижние правые скважины, в этом порядке. Через 10 минут, снова аспирировать PBS и повторить мыть шаги во второй раз. После второй стирки, аспирировать PBS из скважин, как и раньше, рыбалка пипетки отзыв, от открытия канала.
Затем добавьте 100 микролитров 0,5 смеси на мил Poly-D-Lysine раствор, в верхнем левом хорошо чипа. Подождите полтора минуты, а затем заполните нижний левый колодец 100 микролитров раствора Poly-D-Lysine. Повторите этот процесс на правой половине чипа.
Закройте чашку Петри. Затем поместите чип в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации, промыть чип дважды с PBS, как описано ранее.
Далее, аспирировать PBS от устройства. Немедленно добавьте 100 микролитров средств культуры клетки к верхнему левому well обломока. Через полтора минуты добавьте мультимедиа в левый нижний хорошо.
Подождите пять минут, чтобы позволить средствам массовой информации течь через микро-grooves, а затем повторить процесс заполнения на правой стороне чипа. Подготовье клеточной суспензии диссоциированных крысиных гиппокамповых нейронов в соответствии с установленными протоколами. Удалите большинство средств массовой информации в каждом колодец чипа, но оставить каналы заполнены.
Затем немедленно загрузите пять микролитров клеточной подвески в верхнюю правую колодец и еще пять микролитров клеточной подвески в правом нижнем направлении. При загрузке ячеек навемите кончик пипетки на основной канал. После загрузки клеток, передать чип на стадии микроскопа и убедиться, что нейроны находятся в главном канале.
После ожидания пять минут для клеток, чтобы прикрепить, добавить примерно, 150 микролитров нейрональной культуры средств массовой информации для каждого из верхних и нижних правых скважин. Затем добавьте 150 микролитров мультимедиа к каждой из верхних и нижних левых скважин. Обложка чашку Петри и поместите чип в увлажненной лоток в 5%углекислого газа, 37 градусов по Цельсию инкубатор.
Во-первых, удалите 20 микролитров из нижнего левого колодеца аксонального отсека и поместите его в верхний правый колодец соматичного отсека. Подождите две минуты для потока в каждом канале, чтобы уравночные. Затем удалите 50 микролитров мультимедиа из аксонального отсека и добавьте к этому средству 0,3 микролитров одного миллимоляра Alexa Fluor 488 hydrazide.
Pipette вверх и вниз, чтобы смешать раствор, а затем вернуть средства массовой информации, содержащие флуоресцентный краситель обратно в аксональный отсек. На данный момент поместите чип на микроскоп и изображение по желанию. Для выполнения аксотомии внутри чипа, во-первых, удалите средства массовой информации из аксонального отсека, удерживая наконечник пипетки от входа в главный канал.
Храните удаленные средства массовой информации в центрифуге трубки на данный момент. Далее поместите аспирации пипетки рядом, либо вход в главный канал аксонального отсека и аспирировать аксональный отсек полностью. Продолжайте аспирировать область в течение одной-двух минут.
Замените аксональный отсек на сохраненный мультимедиа. Убедитесь, что раствор полностью удален из отсека и аксоны разорваны, глядя на образец под микроскопом. Затем накройте чип и верните его в инкубатор.
Чтобы начать флуоресценцию иммуностимулятора, удалите большую часть средств массовой информации из чипа, сохраняя внутренние отсеки гидратированных. Немедленно добавьте 100 микролитров фиксационо-раствора к верхним колодцам аксональных и соматических отсеков. Через минуту добавьте 100 микролитров раствора фиксации в нижние скважины и зафиксните клетки на 30 минут при комнатной температуре.
Удалите большую часть раствора из скважин и немедленно добавьте 150 микролитров PBS к каждой из верхних скважин аксональных и соматических отсеков. Подождите две минуты для PBS течь в нижних скважинах, а затем, удалить PBS и промыть скважины в два раза больше, используя этот же процесс. После последнего полоскания удалите большую часть PBS из колодцев чипа и немедленно добавьте 150 микролитров PBS с 0,25%тритон x-100 к каждой из верхних скважин аксональных и соматических отсеков.
Подождите 15 минут, а затем удалите большую часть жидкости из колодцев. Сразу же добавьте 150 микролитров блокирующего раствора к каждой из верхних скважин аксональных и соматических отсеков. Через 15 минут удалите большую часть жидкости из колодцев и немедленно добавьте 100 микролитров первичного раствора антител к каждому из верхних колодцев аксональных и соматических отсеков.
Обложка чипа, чтобы свести к минимуму испарение и инкубировать клетки в первичных антител в течение одного часа при комнатной температуре. Затем промойте чип, удалив большую часть раствора и немедленно добавив 150 микролитров PBS к каждой из верхних скважин аксональных и сематических отсеков. Через пять минут снимите PBS с обеих скважин и повторите полоскание еще два раза.
Теперь удалите большую часть жидкости из скважин и немедленно добавьте 100 микролитров вторичных антител в PBS, к каждой из верхних скважин аксональных и соматических отсеков. Обложка чип, чтобы свести к минимуму испарение и инкубировать чип в течение одного часа при комнатной температуре. Как показано ранее, промыть чип три раза с PBS, то, монтировать и изображение чипов, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.
Показано здесь, является бок о бок сравнение нейронов, выращенных на пластиковых чипов и PDMS устройств. Нейронный рост сопоставим в двух платформах до 15 дней в культуре, но в более длительный возраст культуры, изолированные аксоны в пластиковом чипе, кажутся более здоровыми с меньшим избиением. Для дальнейшей визуализации аксонов в аксональных отсеках, эти образцы были также иммунотелин для бета-тубулина III, который показывает здоровый аксональный рост в пластиковых чипов на 22 дней в культуре.
Дальнейшее окрашивание 24-дневными образцами показывает нейроны, выращенные в пластиковых чипах, чтобы выразить как возбуждающие, так и ингибирующие синаптические маркеры, vGlut1 и vGat. Вот два синаптических маркеров в сочетании с ретроградной помечены mCherry нейронов. Чтобы продемонстрировать пригодность этого чипа для исследования травмы аксона и регенерации, ретроградные помеченные нейроны были изображены до и через 24 часа после аксотомии.
Опровержения лампы и регенерации аксона оба очевидны после аксотомии. Эти результаты эквивалентны опубликованным данным с использованием устройств на основе PDMS. Классические многокомпоненциальные чипы обеспечивают простой в использовании вариант для разобщенности нейронов, обеспечивающих долгосрочные нейронные культуры, которые остаются жизнеспособными в течение более трех недель.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы семена соответствующего количества нейронов и убедитесь, что ваш инкубатор хорошо увлажняется во время культуры.
