Во время вирусной инфекции Зика Т-клетки могут проникать в иммунопривилегированные органы для ликвидации вируса, но могут также способствовать иммунопатогенезу, таким как синдром Гийена-Барре или травмы яивок. Основным преимуществом этого метода является то, что он облегчает обнаружение тетрамерных Т-клеток в иммунопривилегированных органах, как во время инфицирования вирусом Зика, так и после иммунизации против вакцинации. В этой модели, вирус Зика инфекция инициируется в интерферон альфа / бета-рецептор нокаут мышей, что позволяет отслеживать вирус Зика конкретных Т-клеток в головном мозге, яички, и селезенки.
Используя подход к окрашивания тетрамеров, можно исследовать только характеристики иммунопривилегированных органов, проникающих в специфические Т-клетки вируса Зика, для изучения вклада Т-клеток в иммунопротекторную и иммунопатогенную клетки. Для инфицирования вирусом Зика, доставить один раз 10 до четырех фокус-образующих единиц вируса Зика в 100 микролитров PBS через ретро-орбитальной прививки в шесть-восемь недель назад интерферон альфа / бета рецептор нокаут мышей. Затем ежедневно следите за весом и клиническими признаками инфицированных животных в течение 15 дней.
Семь дней после прививки, обеспечить инфицированное животное в положении на спине на хирургической пены, и использовать стерильный скальпель, чтобы сделать разрез кожи вдоль средней линии живота. Используйте ножницы, чтобы открыть мышцы живота, и осторожно извлечь печень. Затем, удалить селезенку, и промыть ткани три раза в PBS, чтобы удалить кровь.
После последней стирки поместите селезенку на 1,5 миллилитров ледяной RPMI среды на льду, пока все селезенки были собраны. Чтобы создать одноклеточную подвеску, поместите селезенку в стерильный, 40-микрометровый сетчатый клеточный ситечко поверх 50-миллилитровой трубки и добавьте два миллилитра ледяной среды RPMI, дополненной сывороткой из 10% плода, или FBS, к ситечко. Затем используйте поршень из пятими миллилитров шприца для мацерата ткани через фильтр, используя свежую среду, чтобы промыть выпущенные клетки через сетку.
Перенесите одноклеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку для центрифугации и повторно наполните гранулы пятью миллилитров буфера лиза красных кровяных телец. После пяти-шести минут при комнатной температуре, остановитьлиз с 10 миллилитров ледяной RPMI плюс FBS для второй центрифугации, и повторно гранулы в 10 миллилитров полной среды для подсчета. Семь дней после прививки, обездвижить усыпляемый, инфицированный, самец мыши в положении склонных на разделорезной доске, и обеспечить кожу головы с прямыми один на два зуба щипцом.
Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать разрез средней линии на коже головы, подвергая череп, и использовать острые пинцеты, чтобы зажать две стороны орбиты с острыми пинцетом, фиксируя мозг. Размещение одного кончика острых ножниц радужной оболочки глаза в foramen magnum, вырезать боковой в череп с каждой стороны. Тщательно вырезать из той же полости до средней линии, к носу, сохраняя ножницы советы как можно более поверхностным, чтобы избежать травмирования мозга.
Поднимите мозг с типсами, и использовать острые ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно вскрыть черепных нервных волокон. Затем используйте типсы для переноса мозга в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров ледяной RPMI плюс FBS. Чтобы изолировать яички, поднимите брюшную кожу с типсами, и использовать ножницы радужной оболочки глаза, чтобы сделать продольный разрез через интеграмент и брюшной стенки и подвергать нижнюю часть живота.
Нажмите яички до разреза, и использовать пинцет, чтобы осторожно вытащить жировой слой, чтобы разоблачить шаровые яички с обеих сторон. Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы тщательно вскрыть жировой слой и эпидидимис, и передать яички в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров ледяной RPMI плюс FBS. Чтобы создать одноклеточную суспензию из любой из собранных тканей, поместите орган на стерильный клеточный ситечко со 100-микронной сеткой поверх 50-миллилитровой трубки и добавьте два миллилитров ледяной RPMI плюс FBS к ситечко.
Используя поршень из пятими миллилитрового шприца, пюре ткани, и мыть фильтр со свежей среде, пока орган был полностью землю через сетку. Перенесите одноклеточную подвеску в 15-миллилитровую трубку для центрифугации и повторно посовелите гранулы в пять миллилитров градиентной среды плотности 30%. Тщательно слой клеточного раствора в течение двух миллилитров 70%плотности градиента среды в новой 15-миллилитровой трубки, и отделить клетки по плотности градиентной центрифугации.
Затем перенесите клетки из межфазы между двумя градиентами плотности в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров холодного RPMI плюс FBS для другой центрифугации, и повторно посовечите гранулы в 10 миллилитров ледяной RPMI/FBS для подсчета. Чтобы проанализировать клетки по цитометрии потока, разбавить клетки в пять раз от 10 до шести клеток на 100 микролитров в концентрации буфера FACS, и инкубировать образцы клеток с 10 микролитров анти-мышь CD16/CD32 блокирования антител на образец. После 10 минут при комнатной температуре добавьте 20 микролитров клеток в соответствующее количество колодцев 96-хорошо, круглой нижней пластины в соответствии с экспериментальным протоколом окрашивания цитометрии потока, и добавьте 20 микролитров тетраметной смеси E-белка к каждой скважине для 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте.
В конце инкубации добавьте антитела клеточной поверхности, представляющие интерес для клеток, для 30-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. Далее, мыть клетки два раза с 200 микролитров буфера FACS за стирку, и тщательно повторного перерасхода клеток в каждой хорошо с 200 микролитров свежего буфера FACS. Затем храните образцы при четырех градусах Цельсия, защищенных от света, до их анализа на цитометре потока.
Патологические симптомы и признаки, такие как миелопарализ и моторный парапарез наблюдаются в интерферон альфа / бета-рецептор 1 нокаут мышей семь дней после прививки с вирусом Зика. Изменения веса в инфицированных интерферона альфа / бета-рецептор 1 нокаут животных были проверены в течение 15 дней, с потерей веса впервые наблюдается через четыре дня после инфекции и восстановления веса, начиная с седьмого дня после заражения. Репрезентативные изображения инфицированных мозгов мурина показывают очевидный отек и гиперемию семь дней после прививки от вируса Зика.
Репрезентативные изображения тестов, зараженных вирусом Зика, свидетельствуют о постепенном сокращении с семи до 30 дней после инфицирования. Гистопатологический анализ секций мозга и яичек, инфицированных вирусом Зика, также иллюстрирует влияние разрушительных патологических изменений по сравнению с неинфицированным контролем. Как и ожидалось в макро- и гистопатологических анализах, высокие вирусные нагрузки также обнаруживаются в головном мозге и яичках инфицированных вирусом Зика мышей путем иммуностимулятора.
Это сопровождается надежным CD3-положительным проникновением Т-клеток в мозг после заражения вирусом Зика. Вирус Зика-специфические CD3-положительные, CD8-положительные Т-лимфоциты обнаруживаются как у инфицированных вирусом Зика, так и у вакцин-иммунизированных мышей путем окрашивания тетрамеров Е-белка. E-белок тетрамер-специфических CD8-положительных Т-клеток также могут быть обнаружены в головном мозге и яички семь дней после прививки с вирусом Зика.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в изучении патоген-специфической характеристики Т-клеток в иммунопревалентных органах во время естественных инфекций в животных моделях. Этот метод также может быть применен к другим иммунным органам, таким как плацента или глаз, а также к вирусной инфекции и раку. После этой процедуры тетрамеры MHC-I могут быть использованы для иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного обнаружения патогенных Т-клеток для доступа к распределению Т-клеток мозга или яище.
