Ортопедическая трансплантация клеток аденокарциномы легких мыши в синегенные реципиенты трансплантата позволяет изучать опухолевый образец в присутствии полностью активной иммунной системы в физиологических условиях. Конечно, опухоли развиваются в иммунокомпетентных мышей, и это гораздо более физиологически, что если вы выполняете трансплантацию у иммунодефицитных мышей. Редактирование генов опухолевых клеток перед трансплантацией делает эту модель прямым и экономя времени подходом для изучения влияния генетических факторов на рост опухоли и профили экспрессии генов.
По сравнению с неуязвимыми автохтонными моделями опухолей легких, этот метод позволяет избежать обширного размножения мышей, и поэтому представляет собой уточнение предыдущих моделей мыши рака легких. Перед началом процедуры используйте ножницы, чтобы удалить конец катетерной иглы и полностью протолкнуть катетер над концом иглы. После подтверждения отсутствия ответа на щепотку носа, нанесите мазь на глаза обезболивающей, синергетической 8 до 12 недель мыши и крючок верхних резцев над швовой строки через интубацию платформы с грудью перпендикулярно шва.
Поместите волоконно-оптический кабель между передними конечностями, чтобы осветить грудь и тщательно открыть рот с помощью дезинфицированных плоских типсов для извлечения языка. Ищите излучения белого света, чтобы найти гортани, эпиглотти и arytenoid хрящей. После того, как открытие трахеи хорошо видно, осторожно сдвиньте катетер в трахею, до, но не за пределами бифуркации, чтобы гарантировать равномерное распределение клеток аденокарциномы легких в легких.
Позаботьтесь о том, чтобы вставка катетера была очень гладкой. Если вы чувствуете сопротивление, удалить катетер и подвергать трахеи снова, чтобы избежать травмирования мыши. Быстро удалите иглу из катетера и проверьте, можно ли наблюдать белый свет, сияющий через катетер.
Чтобы подтвердить правильное размещение катетера в трахее, прикрепите к катетеру шприц с одним миллилитров воды. Вода в шприце должна быстро двигаться вверх и вниз во времени с дыханием. Перед доставкой клеточной суспензии разогрейте клетки вручную и загрузите в катетер 50 микролитров клеток.
Как только суспензия аспирируется, прикрепите пустой одноми миллилитровый шприц к катетеру и выпределите 300 микролитров воздуха в катетер, чтобы обеспечить полное распределение опухолевых клеток в легких. Затем аккуратно снимите катетер и поместите мышь на тепловую площадку с мониторингом до полного лежачих. После соответствующей экспериментальной конечной точки, замочите тушу в 70% этанола и закрепите животное до доски для вскрытия.
Сделайте вентраальный разрез средней линии и аккуратно инвертировать кожу, чтобы разоблачить мышцы грудной стенки и органов брюшной полости. Используйте ножницы, чтобы проколоть диафрагму и вырезать ребра, подвергая грудной полости. Вырезать небольшое отверстие в левом желудочков и использовать 27 калибровочных иглы для окаймлять легких три раза через правый желудочек с шестью-восемью миллилитров ледяной PVS на инфузии.
После последней перфузии, легкие должны быть полностью очищены от крови и появляются белые. После сбора урожая используйте ножницы, чтобы измельчить легочную ткань на мелкие кусочки. Перенесите фрагменты легких в двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую 1,5 миллилитров буфера пищеварения легких в течение 30-60 минут инкубации при 37 градусах цельсия, с встряхиванием.
В конце пищеварения перенесите подвеску клетки через 70 микрон-клеточный ситечко в 50 миллилитровую трубку и используйте конец стерильного 10-миллилитрового поршеня шприца, чтобы нажать на все оставшиеся фрагменты ткани через фильтр. Промыть ситечко с 15 миллилитров ПВХ, дополненный 2%FCS. И собирать клетки путем центрифугации.
Повторно приостановить гранулы в один миллилитр хлорида аммония хлорид калия лиза буфера в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре и центрифуги клеток снова. Затем повторно приостановить гранулы белых кровяных клеток в один миллилитр ПВХ дополняется 2%FCS и пятно клеток для потока цитометрического анализа в соответствии с экспериментальным протоколом. Как и ожидалось, выживание мышей-реципиентов коррелирует с количеством приколаированных клеток.
И легкие, собранные во время смерти, демонстрируют равномерное распределение опухолевых узелков по всем долям. При сравнении участков из легких, укрывающих аутохтонные опухоли, с опухолями после ортопедически пересаженных опухолевых клеток легких, никаких морфологических различий не наблюдается. Цитометрический анализ экспрессии клеток легких PD-L1, изолированных через три недели после трансплантации ортопедических опухолевых клеток в иммунокомпетентных мышей, как только что продемонстрировано, показывает вверх-регуляции в PD-L1 клеточной поверхности маркера выражения, по сравнению с в пробирке культурных опухолевых клеток легких.
После ортотопической трансплантации могут применяться и другие аналитические методы, включая иммуногистохимический анализ и профилирование мРНК для решения дополнительных экспериментальных вопросов.
