Этот метод очень продвинутый. Он имеет подразделения биотехнологической области, такие как тканевой инженерии, бесплатной генеративной терапии и скрининга наркотиков. Основным преимуществом этой техники является то, что агрегаты равномерного размера могут быть произведены в простой культуре подвески.
Эта доска представляет возможность новых O-образных сосудов для производства единых агрегатов клеток млекопитающих в орбитальной культуре встряхивания подвески. В орбитальной культуре встряхивания с обычными сосудами круговой поток происходит из-за центробежной силы средней поверхности, и этот средний поток передает клетки к центру дна судов. Этот эффект хорошо известен как парадокс чайного листа Эйнштейна.
Этот эффект вызывает избыточное накопление клеток в центре-внизу клеток и неоднородную агрегацию. С другой стороны, O-образные сосуды устраняют центральную область, которая предотвращает средний поток, подметая клетки в область центра дна. Это ограничивает накопление клеток, которые могут реализовать однородную агрегацию.
Начните с 25-квадратной сантиметровой колбы клеток HEK-293 для каждого судна, которое будет сидеть. Разобщить клетки с помощью 0,25%Трипсин-ЭДТА раствор и собирать клетки с помощью центрифугации. Resuspend в результате гранулы в один миллилитр культуры среды.
Фильтровать подвеску клетки через 40 микрон-клеточный ситечко, чтобы собрать одноклеточную подвеску. Добавьте trypan синий к aliquot подвески клетки и выполните отсчет клетки. Затем приготовьте 20 миллилитров клеточной подвески по 2 раза от 10 до 5 клеток на миллилитр.
Подключите вход O-образной сумки к зажатому 50 миллилитровому шприцу, а затем отсоедините поршень. Опустите подготовленную подвесную ячейку в O-образный мешок через зажатый шприц. Замените первый шприц зажима чистым шприцем.
Добавьте 55 миллилитров воздуха через чистый шприц, чтобы полностью расширить мешок. Flap входной трубки, а затем закрыть вход. Наконец, удалите зажим из трубки.
Инкубировать клетки в O-образный мешок с встряхивания при 45 об / мин в условиях 35 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Чтобы изменить среду в клетках, сначала перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую трубку через вход. Затем центрифуга в течение двух минут при температуре 200g при комнатной температуре.
После аспирации супернатанта добавьте 20 миллилитров среды культуры и повторно посовещайте клетки. Добавьте решетные клетки в O-образный мешок, как и прежде, и верните запечатанный мешок в трясущимся инкубатором. Чтобы собрать клетки, перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую трубку через вход, как и прежде.
Вымойте внутри мешка с 20 миллилитров кальция, магния свободного фосфата буфера солевого раствора, а затем слейте содержимое в трубку, чтобы собрать оставшиеся клетки из мешка. Центрифуга собранной клеточной подвески в течение трех минут при 200 раз G при комнатной температуре, а затем аспирировать супернат. Добавьте 10 миллилитров кальция, без магния PBS и следите за агрегатами.
После центрифугирования, как и прежде, удалите супернат и оставьте гранулы, содержащие агрегаты. Если требуется количество клеток, добавьте четыре миллилитров PBS и один миллилитр трипсина в агрегаты и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы отмежевать клетки для подсчета. Экспериментальные измерения показывают, что агрегаты, выращенные в обычном блюде, имели различные диаметры после пяти дней в орбитальной тряске.
В отличие от этого, агрегаты, выращенные в O-образных блюдах или мешках в течение пяти дней, имели гораздо более однородные диаметры. Согласно измерению размера на основе изображения, традиционная культура блюд показала два разных пика, что указывает на широкое отклонение совокупного размера. С другой стороны, агрегаты в O-образных блюдах и O-образных мешках показали один пик и меньшее отклонение в диаметре, чем в обычном блюде, что говорит о том, что такие агрегаты могут быть более равномерного качества.
Haematoxylin и эозин-окрашивание агрегатов поперечных сечений, показали, что агрегаты, выращенные в обычной тарелке, имели некоторые денуклеированные клетки и некротический ход; однако агрегаты, выращенные в O-образных сосудах, не показали никакого некротического курса, а агрегаты, выращенные в O-образном мешке, были такими же большими, как и в обычном блюде. Количество клеток показало, что более 85% клеток выжили в течение пяти дней культуры подвески в каждом сосуде. Это видео демонстрирует, как обращаться с новыми O-образными сосудами для производства единых агрегатов участка клеток млекопитающих в простой культуре подвески.
