Nosso protocolo fornece uma distinção entre colágeno rico e colágeno sem áreas nas seções do fígado. Pode, portanto, ser usado para estudar os processos de fibrogênese nos maiores detalhes. A principal vantagem da técnica reside no uso de microscopia polarizadora para localizar áreas ricas em colágeno nas seções do fígado.
Nossos protocolos podem fornecer uma grande visão sobre o desenvolvimento da fibrose hepática, e também pode ser adotado para outros tecidos moles, como os pulmões, após certas otimizações. Para começar, remova as seções de fígado congeladas de menos 80 graus Celsius e descongele-as à temperatura ambiente por dois minutos. Fixar as seções com paraformaldeído gelado a 4% em PBS por 10 minutos a quatro graus Celsius, seguido de lavagem cinco vezes com PBS.
Após a última lavagem, limpe o excesso de PBS ao redor da seção do fígado usando tecido e marque um limite de aproximadamente dois por quatro centímetros ao redor da seção do fígado com uma caneta marcador hidrofóbica. Cubra a amostra com PBS, carregue a amostra no estágio AFM e cubra-a com a cabeça AFM. Na microscopia de força atômica ou no software AFM, vá para a guia de configuração e marque um tick no salvamento automático para salvar automaticamente todos os arquivos.
Em seguida, especifique o nome do arquivo e o diretório para salvar os arquivos de medição indo para a guia de configuração e clicando em salvar configurações. Aproxime-se da superfície do tecido com o cantilever AFM ligando o laser e clicando na tecla de aproximação. Após a conclusão da abordagem, retraia a ponta do cantilever clicando na tecla de retração uma vez, o que retrai o cantilever para a extremidade superior da faixa piezo.
Se necessário, realinhe o detector usando botões na cabeça do AFM. Desligue o laser. A dica agora está no foco do objetivo.
Em seguida, sobreponha o campo óptico do microscópio com mapas de medição AFM clicando na guia acessórios e selecionando a calibração óptica de sobreposição direta. Na janela seguinte, clique em Avançar para tirar uma série de imagens do cantilever digitalizando uma área específica. Clique em Avançar novamente para ir para a próxima janela.
Na primeira imagem, clique no centro da ponta do cantilever manualmente para representar a posição da ponta no software. O círculo que representa a posição da ponta pode ser manipulado em tamanho, indicando seu raio para aumentar a precisão. Clique em calibrar para detectar a posição da ponta do cantilever em todas as imagens automaticamente.
Confirme a precisão da detecção de pontas passando pelas imagens. Clique em Avançar e em Concluir para concluir a sobreposição óptica. Em seguida, mova o palco para posicionar uma área rica em colágeno dentro da caixa verde, visível na guia do visualizador de dados, usando a imagem polarizada.
Selecione a área rica em colágeno definindo a área sob a guia de grade e, em seguida, fazendo um retângulo na guia do visualizador de dados usando um longo pressionar no botão esquerdo do mouse dentro da caixa verde especificada. Clique em confirmar nova região de varredura para definir a área selecionada como uma área de medição. Defina os parâmetros do loop de feedback.
Definir eu ganho a 50 hertz e P ganho a 0,001. Em seguida, defina o ponto de ajuste em um nano Newton. Selecione o valor relativo do ponto de ajuste de acordo com as propriedades mecânicas dos materiais estudados e a rigidez do balanço.
Especifique uma linha de base justa para ajustar as curvas de força corretamente. Em seguida, selecione o comprimento do movimento do cantilever no eixo Z de acordo com a topografia da superfície da amostra. Defina o movimento Z para duração constante.
Defina o tempo de extensão para um segundo com atrasos de extensão e retração como zero. Defina a taxa de amostragem em 5.000 hertz. Marque um tick na frente do circuito fechado Z para ajustar automaticamente a distância entre a amostra e a ponta do cantilever durante as medições.
Em seguida, desengate o controle de palco motorizado desmarcando o botão de engate. Ligue o laser e aproxime-se da amostra com o balanço. Clique em iniciar a varredura para coletar curvas de distância de força.
Analise os dados adquiridos usando o software de código aberto AtomicJ. Carregue as curvas de força no programa clicando no ícone de curvas de força do processo e mapas. Em seguida, no assistente de processamento, adicione os mapas a serem analisados clicando no botão Adicionar.
Depois que os mapas forem carregados, clique em Avançar. Especifique as configurações de processamento na próxima janela. Para estimar o ponto de contacto entre a amostra e o cantilever automaticamente utilizando um conjunto de parâmetros de curva de ajuste, utilize a estimativa automática do ponto de contacto.
Determine o ponto de contato entre o cantilever e a amostra pelo método clássico de grade focalizada. Selecione o método de estimação como o método independente do modelo para obter a melhor determinação do ponto de contato com base na qualidade das curvas de força medidas, que precisa ser determinada empiricamente durante a otimização da análise dos dados. Ajuste a curva de recuo de força usando um modelo clássico como L dois clássico para ajuste do modelo.
Defina o ajuste do modelo para a curva de retirada. Defina a proporção de Poisson como 0,45, conforme recomendado para tecidos moles, como o fígado. Defina o ajuste da curva usando um grau de linha de base de três e um grau de contato de um.
Alterar o grau de ajuste polinomial com base na escala de desvios das curvas do modelo. Selecione o modelo usado para ajustar as curvas de retirada como o modelo de Sneddon. Preencha o raio da ponta esférica até 2,9 micrômetros.
Carregue a constante de mola e o invOLS dos arquivos de dados habilitando a leitura e clique em concluir. Após a análise dos dados, percorra as curvas de força. Exclua as curvas de força em que o cantilever se aproximou da superfície da seção do fígado incorretamente.
Essas curvas têm alto ruído e formas aberrantes. Depois disso, os dados podem ser copiados ou exportados. Neste estudo, cortes hepáticos levemente fixos obtidos dos camundongos controle e camundongos com fibrose leve e avançada induzida pela injeção de tetracloreto de carbono foram sondados com AFM.
Áreas próximas às veias centrais correspondentes às áreas onde as fibras colágenas em camundongos tetracloreto de carbono geralmente se formam foram analisadas em fígados controle. A distribuição dos módulos de Young foi reprodutível em diferentes regiões em fígados controle e áreas ricas em colágeno dentro de uma única seção hepática. Em camundongos tratados com tetracloreto de carbono, os mapas de rigidez correspondentes às áreas pericentrais dos depósitos de colágeno mostraram valores significativamente mais altos dos módulos de Young em comparação com áreas equivalentes em camundongos controle.
Além disso, houve um aumento significativo nos valores dos módulos de Young com o tratamento mais longo. O efeito do armazenamento prolongado de cortes hepáticos sobre as propriedades mecânicas das fibras colágenas também foi avaliado. As medidas de AFM mostraram valores significativamente menores de módulos de Young em áreas ricas em colágeno para seções armazenadas por três meses, em comparação com aquelas obtidas dentro de duas semanas.
O tempo de fixação da seção do fígado determina grandemente as propriedades mecânicas da seção do fígado. Recomendamos que os intervalos cronometrados indicados no protocolo sejam rigorosamente seguidos. Após certas otimizações no protocolo, o método dado pode ser usado para quaisquer tecidos moles que apresentem deposição significativa de colágeno, que é detectável por microscopia polarizadora.
A técnica dada fornece aos pesquisadores um protocolo unificado e conveniente para estudar o mecanismo do fígado em toda a saúde e doença.
