Este protocolo descreve um método para a cultura e a passagem de uma importante população celular no pulmão e estabelece uma plataforma fisiologicamente relevante para exposição ambiental. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para investigar a biologia pulmonar no contexto da homeostase e da doença. Este método pode fornecer insights, especialmente sobre doenças pulmonares que afetam os alvéolos pulmonares, incluindo aquelas causadas por variantes genéticas, exposições ambientais, agentes infecciosos ou uma combinação desses fatores.
Demonstrando o procedimento, seremos eu e Rhiannon Werder, auxiliado por Kristy Abo, uma doutoranda, estudante de doutorado, e Olivia Hix, gerente de laboratório de nossos laboratórios. Primeiro, aspire todo o meio CK DCI das gotículas de matriz 3D contendo alveolosferas derivadas da diferenciação direcionada na placa de 12 poços. Adicione um mililitro de despase por gota.
Pipete suavemente a gota na despase usando uma pipeta P-1000. Após a incubação transferir os organoides dissociados de uma gotícula matriz no dispase para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros do Médio e centrífugas modificadas do Dulbecco da Iscove a 300 x g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Aspire o supernatante tanto quanto possível. Resuspenque as células em um mililitro de 0,05% de trippsina por gotícula e transfira de volta para a placa de 12 poços. Incubar isso a 37 graus Celsius por 12 a 15 minutos antes de observar a dissociação sob o microscópio e evitar sobreschier as células.
No final da incubação é obtida uma única suspensão celular. Pare a ação da trippsina com um volume igual de soro bovino fetal contendo meio, seguido de centrífuga a 300 x g por cinco minutos. Lave as células com 10 mililitros de IMDM antes da próxima centrifugação.
Resuspenda as células em um volume apropriado para contar. E então conte as células usando um hemócito. Gerar alveolosferas ao emplacar a suspensão de células únicas de células iAT2 na matriz 3D ou em inserções de cultura celular para a cultura da interface ar-líquido.
Após a contagem das células, determine o número de células desejadas para reproduzir na matriz 3D e centrifugar as células a 300 x g por cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o máximo de supernasce possível usando uma pipeta e resuspense rapidamente as células na matriz 3D. Dispense uma gotícula de matriz 3D em um poço de placa pré-armada de 12 poços usando uma pipeta P-200 sem criar bolhas na gotícula da matriz, e sem permitir que a suspensão da célula se instale enquanto dispensa várias gotículas.
Coloque a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus por 20 a 30 minutos para permitir que as gotículas de matriz polimerizem, em seguida, adicione um mililitro de CK DCI 10 micromolar de Y-27632 médio por poço para cobrir a gotícula da matriz. Mude o DCI médio para CK sem 10 micromolar de Y-27632 após 72 horas e substitua-o por DCI CK fresco a cada 48 a 72 horas. Prepare a cultura celular de 6,5 milímetros recém-revestida de 6,5 milímetros inserindo uma hora antes do uso, diluindo a matriz 2D na mistura de médio/nutrientes de Dulbecco F-12 para a solução de trabalho.
Em seguida, adicione 100 microlitres da matriz diluída por inserção de cultura celular de 6,5 milímetros. Deixe a matriz polimerizar em uma incubadora Celsius de 37 graus por 30 minutos ou em temperatura ambiente a partir de uma hora. Aspire a matriz em excesso da cultura celular insere usando uma pipeta.
Enxágüe-o com DMEM F-12, e aspire imediatamente esta lavagem antes de adicionar as células. Centrifugar as células a 300 x g por cinco minutos e remover o máximo de supernanato possível. Resuspenque as células no volume apropriado para a semente com 100 microlitres de CK DCI 10 micromolar Y-27632 por inserção de cultura celular e adicione 100 microliters ao compartimento apical da inserção da cultura celular.
Agitar suavemente a placa em um padrão cruzado para garantir a distribuição uniforme das células, e verifique-a sob um microscópio com o objetivo de 10X. Adicione 500 microliters de CK DCI 10 micromolar de Y-27632 ao compartimento basolateral de cada inserção de cultura celular, e 48 horas após a semeadura, aspire o meio apical usando uma pipeta para iniciar a interface ar-líquido. Após 72 horas mude o médio basolateral para CK DCI sem 10 micromolar Y-27632, seguido pela substituição do meio basolateral por DCI CK fresco a cada 48 a 72 horas por até 28 dias pós-revestimento.
Os resultados representativos da citometria de fluxo demonstram a facilidade de visualização para a linha SPC2 tendo um repórter tdTomato direcionado à proteína surfactante endógena C locus e rastreamento do programa de células epiteliais alveolares tipo 2 ao longo do tempo na cultura. A expressão de proteína surfactante de células 2 derivada do IPSC C tdTomato foi mantida quando replalada na matriz 3D como esferas e quando banhada em pastilhas de cultura celular. A resistência elétrica transeptelial pode ser medida para determinar a integridade da cultura de interface ar-líquido.
Ao tentar este procedimento evite a dissociação excessiva por tubulação mecânica ou digestão enzimática, pois isso pode levar à baixa viabilidade celular e má sobrevivência. Métodos adicionais realizados após este procedimento são medidas de resistência elétrica transepitenelial para avaliar a integridade da barreira, adição de vírus ou compostos para estimular as células, imunofluorescência e RNA, proteína ou coleta de supernasces. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem novas questões de biologia pulmonar e doenças, como como vírus como o SARS COVID-2 ou compostos como vapores de cigarro eletrônico afetam o epitélio alveolar.
