A espectrometria de massa tem sido amplamente adotada para várias aplicações. A metodologia deste artigo fornece a caracterização inequívoca dos fragmentos de RNA obtidos a partir de um processo enzimático in vitro. As vantagens dessa técnica incluem que o pico de ferro da molécula é obtido, que os experimentos podem ser realizados com pequenas quantidades de material para aplicações in vitro, e que o protocolo pode ser realizado com treinamento mínimo.
A metodologia descrita pode ser amplamente aplicada aos processos de estudo envolvendo DNA, RNA ou proteínas. Exemplos incluem transformações bioquímicas, como informações cruzadas, identificação de modificações químicas ou outras interações biopolímeras e reatividade. Uma dificuldade pode ocorrer desde a acessibilidade até um espectrômetro MALDI ou instalações principais que oferecem este serviço.
Outro aspecto é o estabelecimento do limite de detecção que pode ser maior ou menor dependendo do instrumento. Para começar, ligue o espectrofotômetro UV-Vis e clique no ícone Dolhá-winlab perkinelmer UV para abrir a janela de controle de operação do instrumento. Ligue o espectrômetro do controlador de temperatura Peltier usando o interruptor localizado à direita do instrumento e clique em Scan-Lambda 365, presente em Métodos básicos.
Outra tela abrirá e solicitará ao usuário que garanta que os suportes de celular estejam vazios. Clique em OK e permita que o instrumento realize suas verificações de sistema. Agora, ajuste os parâmetros de digitalização selecionando a Coleta de Dados.
Na nova janela em Configurações de varredura, altere a partida para 350 nanômetros e o final para 215 nanômetros. Ative o Peltier selecionando a vantagem à esquerda do acessório. Em seguida, clique em Multiple Cell Peltier, altere os graus de temperatura Celsius para 25 e clique em Peltier On.Navegue até a guia de informações da amostra e digite o número de amostras, nomes e posição celular desejadas.
Clique em Autozero e insira a cuvette contendo a solução de fundo. Clique em Iniciar e inserir o cuvette na célula desejada e certifique-se de que a janela cuvette seja orientada paralelamente à face frontal do instrumento. Agora, clique em OK para começar a primeira varredura a 25 graus Celsius.
Para medições a temperaturas mais altas, clique em Multiple Cell Peltier, altere a temperatura para a temperatura da amostra desejada e repita a varredura. Clique em Arquivo, Exporte e escolha o local do arquivo desejado e selecione XY Data para obter um arquivo de texto. Para realizar a fosforilação de 1,80 m de RNA, prepare uma solução em um tubo de microclamação de 0,6 microliters adicionando 33,5 microlitradores de água sem RNase, cinco microliters de solução A, seis microlitos de triphosfato de adenosina mililitro, um microlite de 200 micromolar RNA solução aquosa, e 4,5 microliters de polinucleotídeo quinase e misturar a solução suavemente.
Incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por 45 minutos colocando-a em um banho de água. Em seguida, inativando a enzima colocando o tubo de reação em um bloco de calor, pré-aquecido a 65 graus Celsius por 10 minutos. Permita que a solução esfrie até a temperatura ambiente para produzir uma solução final de RNA de 1,80m.
Após a incubação, use 50 microliters desta solução, adicione cinco microliters de solução B e cinco microlitres de solução 1-femtomole de Xrn-1 para realizar hidrólise de RNA. Incubar o tubo de reação à temperatura ambiente por duas horas. Transfira essa mistura de reação para um dispositivo centrífugo do tamanho de um poro de 10 kilodalton e filtre as enzimas por centrifugação por 10 minutos a 700 vezes G.Transfira o filtrado em um tubo de centrífuga de 0,6 mililitro.
Em seguida, adicione 20 microliters de água livre de RNase para lavar o RNA residual no tubo centrífugo, seguido de centrifugação. Por fim, combine este filtrado com o filtrado resultante obtido anteriormente por centrifugação em 10 kilodaltons pore-size centrífuga dispositivo, e congele a solução a zero graus Celsius ou navio para análise. Para desalar e concentrar a amostra, use dicas de pipeta C18 disponíveis comercialmente carregadas com uma cama de mídia cromatografia C18 no final.
Para isso, posicione a ponta de pipeta de 10 microliter em uma pipeta de 10 microliter e lave essa ponta duas vezes com solução de nitrilho acetil aquoso de 50%. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado cada vez e equilibre a ponta C18 com 10 microliters de 0,1% de solução de ácido trifluoroacético aquoso duas vezes. Remova manualmente a ponta C18 da pipeta e fixe-a em uma pipeta de 200 microliter contendo uma ponta de pipeta P200.
Em seguida, mergulhe a ponta C18 na solução resultante preparada durante a hidrólise de oligonucleotídeos de RNA pela Xrn-1 e aspire solte a solução através da ponta C18 10 vezes. Agora, retire a ponta C18 da pipeta P200, posicione-a até uma pipeta de 10 microliter e lave a ponta C18 usando uma solução aquosa de solução de ácido trifluoroacético de 0,1%. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
Lave a ponta C18 com 10 microliters água sem RNase duas vezes. Para detectar na placa MALDI, elute o oligonucleotídeo RNA da ponta C18, imergindo a amostra na matriz desejada e distribuindo a solução de volta para o tubo 10 vezes. Pipeta esta solução em dois pontos separados de um microliter cada um na placa e permitir que as manchas sequem.
A concentração de RNA utilizada neste trabalho foi determinada através de espectroscopia UV-Visível registrada a 90 graus Celsius para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A sequência geral de eventos incluiu duas partes. Um, a eficiente fosforilação de 1,80m de RNA, evidenciada pelo aparecimento de apenas um pico correspondente ao produto esperado.
E segundo, o fragmento de enrolação decorrente do tratamento da mistura amostral com Xrn-1. Os mesmos resultados foram obtidos por meio de uma sequência diferente que continha duas lesões oxidativas. As possíveis alterações a considerar incluem a eliminação do uso do dispositivo de filtragem ou a consideração de diferentes matrizes para a localização de MALDI.
Por exemplo, ácido sinapéico ou ácido picolínico. Os fragmentos de RNA foram obtidos a partir de um processo enzimático. Este processo foi estabelecido por acoplamento MALDI, análise eletroforética, síntese em fase sólida e dicromaísmo circular.
O protocolo descrito tem potencial para ser utilizado em diversas áreas, desde pesquisas nas ciências químicas até aplicações no campo biomédico.
