As células-tronco mesenquimais derivadas da almofada de gordura infrapatelar, ou em suma, IFP-MSCs, são um tipo de célula-tronco relativamente menos estudado. Este protocolo é um método simples, confiável e reprodutível que demonstra o isolamento de IFP-MSCs da articulação de sufocamento de cabras. A principal vantagem da técnica é que um grande número de IFP-MSCs de alta qualidade pode ser obtido.
IFP-MSCs isoladas podem se diferenciar em múltiplas linhagens e possuem amplo potencial regenerativo. Devido à sua localização anatômica, as IFP-MSCs ganharam interesse em reparar defeitos da cartilagem e aliviar a degradação da cartilagem na osteoartrite. O método tem implicações para a terapia baseada em células no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa.
O procedimento para isolamento, expansão e diferenciação de IFP-MSCs será demonstrado pelo Dr. Sugata Hazra e pelo Sr. Aman Mahajan. Para iniciar o isolamento das Células-Tronco Mesenquimais da Almofada de Gordura Infrapatela, ou IFP-MSCs, colete as articulações femorotibiais de cabra abrangendo cerca de 15 centímetros das regiões femoral e tibial dos membros posteriores em uma caixa de amostra de coleta esterilizada. Armazenar a amostra a quatro graus Celsius para transporte para o laboratório para processamento posterior.
Coloque a amostra em uma placa de Petri de 150 milímetros e certifique-se de processar a amostra assepticamente e um armário de biossegurança durante todo o procedimento. Enxágue bem com PBS autoclavado suplementado com antibióticos. Mantenha a amostra hidratada usando PBS.
Examine cuidadosamente as regiões anatômicas da amostra. Para facilitar o acesso, remova os tecidos extras de ambos os ossos longos completamente, segurando a superfície final do osso do fêmur com uma mão e cortando-a longitudinalmente em direção à articulação usando uma tesoura afiada. Em seguida, sem perturbar o tecido ao redor da cápsula articular, remova os músculos e o tecido adiposo do osso.
Da mesma forma, faça outra incisão na extremidade tibial da amostra e remova os músculos e o tecido adiposo do osso tibial. Certifique-se de que ambos os ossos longos estão completamente expostos e que a cápsula articular é visível. Em seguida, faça uma incisão de ambos os lados da membrana sinovial para abrir a articulação articular.
Corte a patela livre da membrana sinovial e dos ligamentos patelares usando tesouras e pinças frescas esterilizadas. Coloque imediatamente a patela separada em uma placa de Petri contendo PBS. Da patela separada, remova toda a almofada de gordura presente na superfície interna usando tesouras e pinças.
Colete-o em outra placa de Petri fresca e pice-o usando um bisturi. Inclua outras ferramentas cirúrgicas para obter os pequenos segmentos de gordura de cerca de dois a três milímetros. Use uma espátula para transferir o tecido picado para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e lave-o três vezes com PBS suplementado com antibióticos por 15 minutos à temperatura ambiente usando um misturador de tubo de ensaio.
Para digestão enzimática, incubar cerca de cinco gramas do tecido picado no Dulbecco's Modified Eagle Media, ou DMEM, meio de baixa glicose contendo 1,5 miligramas por mililitro de colagenase tipo II e 2% FBS a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Aspirar cuidadosamente o tecido digerido e filtrá-lo através de um filtro celular de 70 mícrons para remover qualquer parte não digerida. Centrifugar o filtrado num tubo de centrifugação de 15 mililitros a 150 vezes g durante cinco minutos.
Remova o sobrenadante antes de lavar o pellet celular com DMEM de baixa glicose duas vezes. Ressuspeite o pellet em DMEM completo, também conhecido como mídia de expansão. Semeia as células em uma placa de Petri de 150 milímetros e cultive-as no meio de expansão suplementado com cinco nanogramas por mililitro de Fator de Crescimento de Fibroblastos Básicos, ou BFGF, e 50 microgramas por mililitro de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico.
Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% para permitir que as células adiram e proliferem. Monitore a fixação e o crescimento das células diariamente. Para manutenção e expansão adequadas dos IFP-MSCs, troque a mídia a cada três dias.
Ao mudar o meio, adicione cinco nanogramas frescos por mililitro de BFGF e 50 microgramas por milímetro de sal trissódico de ácido 2-fosfo-L-ascórbico diretamente à placa de Petri. Uma vez que as células se tornem 80% a 90% confluentes, subcultura-as removendo o meio de expansão da placa de Petri e lavando as células com 1X PBS. Em seguida, adicione quatro mililitros de 0,25%Tripsina-EDTA ao prato e incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%.
Após quatro minutos, toque na placa de lado para desalojar as células. Confirme o descolamento completo de todas as células ao microscópio. Uma vez confirmado, adicione um volume igual de meios de expansão para neutralizar a tripsina.
Use uma pipeta para coletar essas células dissociadas em um tubo fresco de polipropileno de 15 mililitros e centrifuga-as a 150 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume desejado do meio de expansão. Conte as células usando o método padrão de contagem de células e subcultivá-las para expansão adicional a uma densidade de semeadura de 10.000 células por centímetro quadrado em uma placa de Petri de 150 mililitros.
Para todos os ensaios, use uma monocamada confluente de células de número de passagem P2 a P5. Quando as células expandidas atingirem 80% a 90% de confluência, dissociar as células usando a solução de tripsina-EDTA antes de peletá-las em um tubo de centrífuga de 15 mililitros a 150 vezes g por cinco minutos. Em seguida, ressuscite a pelota no plasma de cabra a uma densidade de 2 milhões de células por 50 microlitros. Adicionar 50 microlitros de plasma contendo as células a uma placa de Petri esterilizada de 90 milímetros, seguida da adição de cloreto de cálcio a uma concentração final de 0,3%Misture bem para fabricar hidrogel de plasma reticulado.
Depois de incubar o hidrogel fabricado a 37 graus Celsius por 40 minutos, transfira os hidrogéis para placas de cultura de tecido de 24 poços contendo meios condrogênicos. Troque a mídia a cada três dias durante 14 dias. Os hidrogéis cultivados em meio DMEM completo sem TGF-beta 1 são considerados controles não induzidos.
Após 14 dias de diferenciação condrogênica de células em hidrogel plasmático, lavar os hidrogéis três vezes com PBS por cinco minutos cada e fixar as amostras em formalina tamponada neutra por três horas. As IFP-MSCs isoladas foram homogenicamente aderentes e atingiram morfologia alongada dentro de 24 horas após a cultura in vitro. As células proliferaram eficientemente de 80% a 90% de confluência dentro de seis dias de expansão e apresentaram capacidade clonogênica, indicando capacidades proliferativas e de auto-renovação eficientes.
Quando tratadas para se diferenciar em linhagem adipogênica, as células isoladas produziram gotículas lipídicas, o que foi confirmado pela coloração Oil Red O nos dias 14 e 21. Tais gotículas de óleo não eram visíveis nas células sem fatores indutores adipogênicos. As células isoladas encapsuladas em hidrogel plasmático apresentaram a formação de neotecido branco e brilhante após 14 dias no grupo induzido apresentaram potencial condrogênico.
O grupo não induzido tinha tecido branco pálido com brilho reduzido. Além disso, a coloração histológica positiva para Alcian Blue e Safranin O no grupo induzido indicou que as células poderiam secretar glicosaminoglicanos sulfatados, um dos principais componentes da matriz cartilaginosa. Em contraste, as seções de hidrogel dos grupos não induzidos foram negativas para coloração Safranin O e Alcian Blue, confirmando o potencial de diferenciação condrogênica das células-tronco mesenquimais apenas na presença de estímulos condrogênicos.
As células isoladas induzidas com meio osteogênico apresentaram coloração positiva para fosfatase alcalina, confirmando a mineralização ao final de 14 dias. Após 28 dias de indução osteogênica, as deposições calcificadas foram observadas com coloração S Vermelha de Alizarina. Os resultados ressaltaram o potencial de diferenciação das células induzidas em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas.
É essencial processar a amostra em condições assépticas para evitar a contaminação. Também é importante identificar a localização correta da patela. Este procedimento abre caminho para isolar vários tipos de células, como condrócitos articulares, fibroblastos ligamentares e células-tronco da sinóvia e do líquido sinovial, tendo amplas aplicações na medicina regenerativa.
Após o isolamento de IFP-MSCs usando essa técnica, sua eficácia foi particularmente investigada para a regeneração de tecidos musculoesqueléticos, como cartilagem, osso e ligamento, usando abordagens livres de andaimes e andaimes.
