Microscopia crio-elétron de partículas únicas é o método para determinações estruturadas de macromoléculas em resolução quase atômica. Vários pacotes de software estão disponíveis para processamento de imagens e cálculos de estrutura, mas o resultado em mapas 3D muitas vezes varia em qualidade e resolução devido às diferenças nos algoritmos aplicados durante os cálculos. Assim, usar uma combinação de diferentes programas é muitas vezes benéfico para alcançar os resultados ideais.
Este protocolo orienta os usuários a navegar em três diferentes plataformas de processamento crio-EM:CryoSPARC, RELION e Scipion. Vamos demonstrar como usar este pipeline para obter uma estrutura de alta resolução do vírus associado ao adeno, que é um vetor amplamente utilizado para a terapia genética. Depois de abrir o CryoSPARC v3 em um navegador da Web e criar o espaço de trabalho para o projeto, navegue até o novo espaço de trabalho e abra o job builder no painel certo.
Clique em importar filmes e forneça o caminho dos filmes e ganhe o caminho do arquivo de referência. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição. Em seguida, clique na fila, selecione uma faixa para executar o trabalho e um espaço de trabalho e clique em criar.
Correção de movimento de patch aberto e o cartão de trabalho de filmes de importação. Em seguida, arraste a saída imported_movies para o espaço reservado para os filmes no novo trabalho e faça fila no trabalho. Para executar a função de transferência de contraste ou estimativa ctf, abra a estimativa ctf de patch.
Insira os micrografos gerados e faça fila no trabalho. Para inspecionar os micrografos corrigidos por CTF e selecionar um subconjunto para posterior processamento, abra as exposições de cura, insira as exposições obtidas da etapa anterior e faça fila no trabalho. Após o trabalho entrar no modo de espera, clique na aba interativa no cartão de trabalho.
Ajuste os limites dos parâmetros e aceite ou rejeite micrografos individuais para posterior processamento. Ao processar os dados atuais, defina o limiar superior do astigmatismo para 400 angstroms, ctf encaixar resolução para cinco angstroms e espessura relativa de gelo para dois. Em seguida, clique em feito para selecionar os micrografos para processamento a jusante.
Para escolher manualmente, abra o catador manual. Insira as exposições aceitas e faça fila no trabalho. Em seguida, clique na guia interativa, defina o tamanho da caixa para 300 pixels e clique em algumas centenas de partículas em vários micrografos, evitando partículas sobrepostas.
Uma vez terminado com a seleção, clique em fazer a colheita de partículas de extrato. Em seguida, para gerar modelos para a colheita automatizada de partículas, clique na classificação 2D e insira as picaretas de partículas geradas. Em seguida, mude o número de classes 2D para 10 e faça fila no trabalho.
Em seguida, abra as classes 2D selecionadas e insira as partículas e as médias de classe obtidas na etapa anterior. Em seguida, clique na guia interativa, selecione classes 2D representativas com uma boa relação sinal-ruído e clique em feito. Para a coleta de partículas baseada em modelos, abra o catador de modelos e insira as classes e micrografias 2D selecionados.
Em seguida, defina o diâmetro da partícula para 220 angstroms e faça fila no trabalho. Finalmente, extrato aberto de micrografos e insumo os micrografos e partículas obtidos a partir da inspeção de picaretas de partículas. Em seguida, defina o tamanho da caixa extraída para 300 pixels e faça fila no trabalho.
Para classificação 2D, clique na classificação 2D e insira as partículas extraídas. Em seguida, defina o número de classes 2D para 50 e faça fila no trabalho. Em seguida, abra selecionar classes 2D e insira as partículas obtidas e as médias de classe.
Clique na aba interativa. Escolha as classes 2D com base na resolução e no número de partículas da classe e clique em feito. Para gerar um volume 3D inicial, abra a reconstrução ab-initio e insira as partículas da classificação 2D final.
Em seguida, ajuste a simetria para icosahedral e faça fila no trabalho. Em seguida, abra o refinamento homogêneo, insira o volume da etapa anterior e as partículas da classificação 2D final. Em seguida, mude a simetria e enfie a fila do trabalho.
Quando o trabalho estiver concluído, inspecione a correlação da concha Fourier ou a curva FSC e baixe o volume para examinar na Quimera UCSF. No CryoSPARC v3, abra a carteira de trabalho da seletiva classe 2D da classificação final 2D. Em seguida, na guia detalhes, clique em trabalho de exportação.
Usando PyEM, converta o particles_exported. cs arquivo para formato estrela executando o comando indicado. Depois de clicar na extração de partículas, na guia I/O, insira os micrografos e coordenadas corrigidos pelo CTF.
Em seguida, clique na guia extrato, altere o tamanho da caixa de partículas para 300 pixels e execute o trabalho. Para refinamento 3D, use o mapa gerado no CryoSPARC v3 como modelo inicial em RELION-3. Selecione o método de importação e defina os parâmetros indicados na guia I/O.
Em seguida, na guia outros, selecione o mapa CryoSPARC v3 como o arquivo de entrada, altere o tipo de nó para referência 3D e execute o trabalho. Em seguida, selecione o refino automático 3D e na guia I/O, defina imagens de entrada como as partículas. arquivo estrela do último trabalho de seleção.
Use a reconstrução cryoSPARC v3 como mapa de referência, clique na guia de referência e altere o filtro inicial de baixo passe para 50 angstroms e simetria para icosaedral. Em seguida, na guia de otimização, altere o diâmetro da máscara para 280 angstroms e execute o trabalho. Para pós-processamento, clique no pós-processamento.
E na guia I/O, insira os meios mapas e a máscara criados e defina o tamanho do pixel calibrado para 1.045 angstroms. Em seguida, na aba afiar, para estimar o fator B automaticamente, entrada sim. Para menor resolução para ajuste automático B, entrada 10.
E para usar seu próprio fator B, entrada não. Finalmente, na guia do filtro, defina pular a ponderação do FSC para não e executar o trabalho. Para treinamento de polimento, polimento bayesiano aberto.
E na guia I/O, insira os micrografos, partículas e PostProcess corrigidos por movimento. arquivo estrela obtido anteriormente. Clique na guia de treinamento e defina os parâmetros ideais do trem para sim, fração de pixels Fourier para testes para 0,5 e use tantas partículas para 5.000.
Então corra o trabalho. Uma vez terminado o trabalho de treinamento, clique no polimento bayesiano. Em seguida, na guia de treinamento, defina os parâmetros ideais do trem para não.
Selecione a guia polimento e em arquivo de parâmetro otimizado, especifique o caminho para o opt_params_all_groups. arquivo txt da etapa anterior e clique em executar. Para estimar aberrações de ordem mais alta, abra o refinamento ctf aberto.
E na guia I/O sob partículas, selecione o caminho para o arquivo estelar contendo partículas polidas do recente trabalho 3D refinado. Em seguida, no arquivo STAR pós-processo, defina o caminho para a saída do trabalho pós-processamento mais recente. Em seguida, selecione a guia de ajuste e defina a ampliação anisotropica estimada para no.
Realize o encaixe do parâmetro CTF para não. Estimativa de feixe para sim. Também estimar trefoil para sim.
E estimar aberrações de quarta ordem para sim. Então corra o trabalho. Para refinar e validar ainda mais o mapa RELION-3, inicie o Scipion 3 e crie um novo projeto.
No painel protocolos esquerdos, selecione a queda das importações e clique em partículas de importação. Altere a importação de parâmetros para RELION-3 e arquivo estrela para postprocess.star. Em seguida, especifique os parâmetros de aquisição como demonstrado anteriormente e clique em executar.
Em seguida, clique no dropdown das importações e selecione volumes de importação. Sob importação, dê o caminho para o mapa RELION-3, altere a taxa de amostragem do tamanho do pixel para 1.045 angstroms por pixel e execute. Para realizar um alinhamento global, selecione o menu suspenso de refinar no painel protocolos e clique em xmipp3-highres.
Insira as partículas e volumes importados das etapas anteriores como imagens em tamanho real e volumes iniciais, respectivamente, e defina o grupo de simetria para icosaedral. Em seguida, na guia de alinhamento de imagem sob atribuição angular, escolha global, defina a resolução de destino máxima para três angstroms e execute o trabalho. Para realizar um alinhamento local, selecione xmipp3-highres global, mude continue da corrida anterior para sim e selecione o trabalho anterior.
Em seguida, na guia de atribuição angular, altere o alinhamento da imagem para local e defina a resolução máxima de destino para 2,1 angstroms. Após o término, na janela de resultados xmipp3-highres, clique em gráficos de resolução de exibição para ver como o FSC mudou após o refinamento e clique no histograma do plot com alterações angulares para ver se as atribuições de ângulo de Euler mudaram. Inspecione o volume na Quimera UCSF.
Amplie e procure recursos de alta resolução. Micrografos com bom ajuste ctf e baixo astigmatismo foram selecionados para posterior processamento, enquanto aqueles com alta astigmatismo e desistência foram descartados. Foram selecionadas médias de classe 2D contendo classes bem definidas, e aquelas com baixa resolução, ruído e partículas parciais foram rejeitadas.
Regiões do mapa de microscopia crio-elétron equipado com coordenadas atômicas de um vírus associado ao adeno são mostradas aqui. As densidades em bem definidas permitem a montagem de cadeias laterais de aminoácidos individuais, moléculas de água e íons de magnésio. As curvas FSC calculadas usando o CryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion indicam uma resolução crescente em todo o fluxo de trabalho, as estimativas de resolução em quatro fatias diferentes através das estruturas e histogramas de resolução demonstram a melhoria incremental na resolução local entre os mapas ao longo do fluxo de trabalho.
A combinação de algoritmos de processamento crio-EM de CryoSPARC, RELION-3, Scipion e Phoenix resultou em um aumento de resolução das estruturas de vírus associadas ao adeno de 2,9 para 2,3 angstroms em todo o pipeline de processamento. É importante lembrar que os parâmetros especificados em cada etapa são amostrais e dependentes de microscópio. Além disso, a capacidade de alcançar alta resolução depende muito da qualidade da amostra e dos dados brutos.
Neste vídeo, apresentamos o robusto fluxo de trabalho de SP para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software. Usando essa abordagem, pode-se implementar algoritmos para vários programas para refinar e validar estruturas criogenas. Este fluxo de trabalho pode ser aplicado aos cálculos estruturais de uma grande variedade de conjuntos macromoleculares.
