O estudo da saída da sinapse imunológica tem sido restrito principalmente a métodos microscópicos. Os BSLBs expandiram nosso repertório de ferramentas que podem ser usadas para estudar a saída de sinapses imunes de células T, incluindo citometria de fluxo, microscopia, proteômica e tecnologias de sequenciamento de RNA. Como tal, os BSLBs podem ser utilizados em uma ampla variedade de questões de imunologia e na identificação da composição e regulação bioquímica da produção celular T.
Isso inclui, por exemplo, o estudo de receptores de antígeno quimérico, drogas que inibem vias específicas de sinalização, ou a ablação genética de genes de interesse. Um dos aspectos mais críticos deste protocolo é otimizar as calibrações proteicas e o painel de citometria de fluxo multicolor necessário para o rastreamento da partícula trans-sináptica de interesse. Isso requer a iteração sistemática de concentrações proteicas, concentrações de anticorpos e configurações de instrumentos.
Comece diluindo um microliter de solução de contas com 1.000 microliters de PBS. Conte as contas usando uma câmara hemócica e calcule sua concentração por mililitro. Em seguida, calcule o volume de contas de sílica necessárias para 500.000 BSLBs finais por ponto de titulação.
Transfira o volume necessário de contas de sílica para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Lave as contas de sílica três vezes com um mililitro de PBS estéril e centrifugar as contas. Prepare três volumes de mistura mestre lipossosome contendo um percentual final de 12,5 mols de fosfolipídios contendo níquel.
Use a mistura de mestre lipososome para resuspensar as contas de sílica lavadas. Em seguida, misture-o suavemente por pipetting para cima e para baixo metade do volume total. Usando uma técnica estéril, adicione argônio ou gás nitrogênio ao tubo para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
Adicione argônio aos estoques lipíduos de 0,4 milimilito. Armazene o estoque e manipule usando uma técnica estéril. Mova os BSLBs para a batedeira vertical e misture por 30 minutos à temperatura ambiente usando mistura orbital a 10 RPM.
Em seguida, gire as contas por centrifugação por 15 segundos à temperatura ambiente em uma minicentrifuagem de bancada. Bloqueie os BSLBs formados adicionando um mililitro de 5%BSA contendo 100 micromolar de sulfato de níquel para saturar os locais NTA nos BSLBs. Lave três vezes usando o buffer HBS-HSA para remover a solução de bloqueio em excesso.
Pegue uma nova placa U-bottom ou V-bottom 96-well e prepare diluições seriais duas vezes das proteínas. Resuspenja os BSLBs preparados em um volume de tal forma que 100 microliters de tampão HBS-HSA contenham 500.000 BSLBs. Em seguida, pegue outra placa de 96 poços de fundo U ou V e transfira 100 microliters da suspensão BSLB para os poços de tal forma que cada poço receba 500.000 BSBLs.
Gire a segunda placa à temperatura ambiente por dois minutos a 300x G.Descarte o supernadante e transfira volumes de 100 microliter da placa de titulação proteica para a placa que contém os BSLBs sedimentados. Misture suavemente, evitando o excesso de geração de bolhas durante a pipetação. Use papel alumínio para protegê-lo da luz e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos a 1.000 RPM.
Em seguida, lave a placa três vezes adicionando tampão HBS-HSA à placa e gire-a à temperatura ambiente por dois minutos a 300x G.Conte as células após a lavagem. Em seguida, dilui-os a uma concentração final de 2,5 milhões por mililitro usando o meio de ensaio de transferência sináptica. Uma vez que os BSLBs são carregados com a mistura de proteína, lave os BSLBs duas vezes com tampão HBS-HSA para remover o excesso de proteínas não ligadas.
Resuspend 500.000 BSLBs por poço em 200 microliters de tampão HBS-HSA. Transfira 100 microliters de BSLBs por poço para uma nova placa U-bottom de 96 poços para fazer uma duplicata, de tal forma que a quantidade final de BSLB por poço seja de 250.000. Gire os BSLBs a 300x G por dois minutos em temperatura ambiente.
Descarte o supernatante e, em seguida, resuspenque os BSLBs usando 100 microliters de suspensão celular T. Misture suavemente para evitar a formação de bolhas. Incubar as coculturas por 90 minutos a 37 graus Celsius.
Proteja as células da luz e esfrie as co-culturas, primeiro incubando-as à temperatura ambiente por um mínimo de 15 minutos. Centrifugar as co-culturas à temperatura ambiente por cinco minutos a 500x G.Descarte o sobrenasciente e resuspenque as co-culturas em cálcio e magnésio livre de íons 2%BSA PBS à temperatura ambiente para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 minutos e proteja-as da luz.
Prepare a mistura mestre de anticorpos usando 0,22 micrômetros filtrados 2% BSA e PBS como tampão de coloração. Esta mistura mestre fornecerá um bloqueio extra. Gire as co-culturas a 500x G por cinco minutos e quatro graus Celsius.
Descarte os supernantes e use uma pipeta multicanal para resuspensar as células na mistura mestre de coloração contendo concentrações otimizadas de anticorpos. Inclua células com rótulo de isótipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes, e células e BSLBs manchadas sozinhas. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo metade do volume.
Incubar por 30 minutos no gelo e protegê-los da luz. Lave as células e os BSLBs duas vezes usando PBS 2%BSA com frio gelado. Gire-os a 500x G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, verifique a cocultura sedimentada na parte inferior dos poços. Em seguida, resuspenja as co-culturas lavadas em 100 microliters de PBS e adquira imediatamente. Ative a escala de log para luz dispersa lateral e o parâmetro de tempo de voo para luzes de lado e para a frente.
Adquira os padrões MESF, garantindo que tanto as populações dim-set quanto as mais brilhantes caiam na faixa linear do instrumento. Em seguida, adquira amostras de compensação, calcule a compensação e aplique a matriz de compensação ao experimento. Adquira e economize um mínimo de 20.000 padrões totais de MESF para cada canal de quantificação.
Evite o uso de fluido de bainha FACS ou similar a contas MESF resuspend, pois estas contêm sais e álcoois que destruirão os fluorochromes, levando a picos de fluorescência mais amplos e alto erro. Para aquisição utilizando samplers de alto rendimento, defina a aquisição de instrumentos à Standard, defina a aquisição de amostras para 80 microlitros. Taxa de Fluxo amostral entre dois e três microliters por segundo, amostra de Volume de Mistura em 50 microliters, mistura amostral de 150 microliters por segundo e mistura por poço entre três e cinco.
Adquira um mínimo de 10.000 BSLBs únicos por amostra. Finalmente, exporte os arquivos FCS. Um exemplo de medidas quantitativas de citometria de fluxo de ICAM-1 na superfície de células Amigillar e células T auxiliares é mostrado aqui.
As imagens representativas descrevem a estratégia de gating para analisar células únicas CXCR5 B e células T foliculares isoladas de amígdalas palatinas humanas. Esta estratégia de gating sequencial identifica eventos ao vivo únicos dentro da janela de aquisição contínua. Os doublets, a expressão da superfície celular do ICAM-1 em comparação com os controles FMO e os controles de FMO rotulados com isótipos relevantes das populações, são mostrados aqui.
Gating e medição de MFIs de diferentes populações padrão de MESF nos histogramas sobrepostos das populações do MESF são mostrados aqui. Os valores representam os MFIs para cada uma das cinco populações do MESF. A regressão linear do MESF sobre a CMFI para as populações do MESF é apresentada aqui.
A inclinação extrai MESF vinculado às células dos dados fcm do ICAM-1 na superfície de células B tonsilárgas em TFH. A conversão para densidades moleculares absolutas segue essas simples operações matemáticas. As imagens representativas mostram a análise de citometria de fluxo de BSLBs reconstituídas com densidades aumentadas de histidinas monoméricas recombinantes ICAM-1 12.
Análises de regressão da concentração de referência ICAM-1 sobre densidade medida são mostradas aqui. A inclinação é usada para calcular concentrações-alvo de proteína para atingir a densidade das células. Os diagramas de fluxo mostram os passos críticos para co-culminar células T com BSLBs, reconstituindo membranas modelo na medição subsequente da transferência de partículas com citometria de fluxo.
A estratégia de gating para identificar BSLBs e células únicas dentro da janela de aquisição contínua é mostrada aqui. Um dos aspectos mais importantes deste protocolo é que, para manter a reprodutibilidade dos resultados, cada vez que você muda os estoques de proteínas ou lipídios, você precisa realizar uma nova análise de calibração. Para descobrir novas moléculas eficazes secretadas por diferentes subconjuntos de células T, os BSLBs podem ser ainda mais isolados pela classificação celular ativada pela fluorescência, como submetidos à análise transcriômica e proteômica.
Nossos colegas da Universidade de Oxford têm usado essa tecnologia para estudar e demonstrar novas interações receptor-ligantes, e também para estudar os efeitos das ablações genéticas na saída da sinapse imunológica das células T.
