Isso fornece resultados de alta qualidade para o metabolismo do fosfato de inositol em todos os organismos que testamos até agora. Ele também fornecerá informações sobre a nova via biossintética celular que estamos atualmente cientes. A análise do metabolismo do fosfato de inositol por CE-ESI-MS é mais rápida, altamente sensível, e capaz de fornecer informações de estrutura para conjuntos de fosfato de inositol.
Para começar, configure um sistema de Espectrometria de Massa de Ionização por Eletrospray de Eletroforese Capilar ou CE-ESI-MS consistindo de um sistema CE comercial e um espectrômetro de massa em tandem quadrupolo triplo, equipado com uma fonte ESI Agilent Jet Stream. Em seguida, conecte o divisor de fluxo 1:100 da bainha e a saída da bomba de cromatografia líquida isocrática e verifique se o frasco de entrada do sistema CE está na mesma altura que a ponta do pulverizador do analisador de massa. Em seguida, utilize a versão MassHunter Workstation ou software MS semelhante, para controlar todo o sistema e aquisição e análise de dados.
Depois de preparar o tampão de corrida CE e o líquido da bainha, instale o líquido da bainha purgando a cinco mililitros por minuto durante cinco minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto e a pressão da bomba para 180 bar. Certifique-se de que a tubulação reciclada se conecta de volta ao frasco líquido da bainha para reutilizar o solvente.
Em seguida, usando um cortador de coluna capilar com uma lâmina diamantada rotativa, corte adequadamente ambas as extremidades de um capilar CE-MS com uma janela de detecção UV. Em seguida, remova dois a três centímetros de revestimento de poliimida em ambas as extremidades com um isqueiro e limpe a superfície capilar com isopropanol. Para instalar o capilar, combine o capilar no CE-MS.
Em seguida, clique no botão Alterar e instale o no dispositivo CE. Para ativar o capilar, primeiro lave o capilar com um hidróxido de sódio molar, seguido de água por 10 minutos e, em seguida, o tampão de corrida CE por 15 minutos. Em seguida, insira o capilar no pulverizador CE-MS.
Usando uma lupa e o parafuso de ajuste no pulverizador, ajuste com precisão a saída capilar, garantindo que a extremidade capilar se projete aproximadamente 0,1 milímetros para fora da ponta do pulverizador. Verifique a estabilidade do pulverizador ESI no modo Full Scan. A flutuação dos eletroferogramas de íons totais deve estar dentro de 5% Em seguida, realize um teste com padrões de fosfato de inositol.
Após a preparação da mistura de padrões internos, misture 10 microlitros da amostra com 0,5 microlitros da mistura de padrões internos e um frasco para injetáveis de amostra CE. Ao usar o sistema de reabastecimento, clique no botão Alterar garrafa. Coloque os 250 mililitros preparados de buffer de funcionamento CE no frasco de eletrólitos.
Em seguida, clique em Limpar tubos mantendo a agulha de reabastecimento em um frasco de água. Defina os parâmetros ESI e MS. Em seguida, otimize os parâmetros da fonte usando um otimizador de fonte com uma mistura de padrões de polifosfato de inositol e várias configurações de monitoramento de reação usando o MassHunter Optimizer com todos os padrões.
Em seguida, execute uma corrida para os extratos de fosfato de inositol e verifique os resultados. Defina uma sequência quando houver mais amostras. Após a medição, deixe o MS estar no modo de espera e não desligue a bomba de cromatografia líquida.
Substitua o pulverizador CE-ESI-MS por um pulverizador LC-ESI-MS quando não houver fornecimento de líquido da bainha. Para análise de dados, abra o software de Análise Quantitativa e crie um lote para todas as amostras. Em seguida, crie um novo método a partir dos dados de monitoramento de reações múltiplas adquiridas e defina os fosfatos de inositol de carbono-13 como padrões internos.
Em seguida, verifique a configuração do Composto de Monitoramento de Reações Múltiplas, Tempo de Retenção, Padrões internos, Concentração e Qualificador. Passe a Validação e Saída para aplicar o método ao lote atual. Salve o método.
Em seguida, verifique se cada pico no lote está integrado corretamente. Caso contrário, integre manualmente o pico. Exportar os resultados para uma planilha e quantificar os pirofosfatos de inositol, comparando a resposta de pico do anolito com a respectiva resposta de pico do isótopo estável rotulado padrões internos com concentrações conhecidas.
Finalmente, com a concentração medida no fosfato de inositol, solução de extrato e seu volume, calcular as quantidades absolutas e normalizar ainda mais a quantidade por contagens de células ou teor de proteína. Calcule a concentração celular com base na contagem de células e no volume celular médio das células HCT116. Os eletroferogramas de íons extraídos dos padrões de pirofosfato de inositol em uma concentração de dois micromoles são mostrados aqui.
O metabolismo dos pirofosfatos de inositol em mamíferos com suas estruturas simplificadas é inserido. Uma execução ce-esi-ms de células HCT116 da University College London ou UCL é mostrada aqui. O CE-MS foi usado para quantificar a variação nos níveis de IP8 entre as células HCT116 da UCL e as do NIH.
As células HCT116 da UCL contêm níveis sete vezes mais elevados de IP8 do que as do NIH. O acúmulo significativo de 1, 5-IP8 nas células HCT116 UCL é paralelo a um aumento considerável no 1-IP7. A análise CE-ESI-MS de células HCT116 tratadas com fluoreto de sódio do NIH demonstrou uma elevação de 5-IP7, juntamente com uma redução no IP6 e um aparecimento de 5-PPIP4.
Embora os níveis de 1-IP7 tenham diminuído até certo ponto, ele não está completamente ausente nas células tratadas com fluoreto de sódio, mas principalmente abaixo do limite de detecção. É importante formar uma classe CE-ESI-MS estável. Recomendamos verificar a repetibilidade e a sensibilidade do sistema antes das medições.
Esta técnica permite fornecer metabolismo de fosfato de inositol, implantes e tecidos, e também fornecer uma oportunidade para estudar de perto o pirofosfato de inositol biologicamente relevante.
