O fluxo de trabalho consiste em cultivar células em condições ambientais estritamente controladas, resfriando-as rapidamente usando água derretida/gelo e fixação com concentração pré-otimizada de formaldeído e tempo de incubação. A reação de fixação é então saciada usando o excesso de compostos primários contendo grupo de amino, como glicina ou tryps. As células são coletadas, lavadas e podem ser armazenadas congeladas.
As células fixas podem ser mecanicamente ou quimicamente lísedas, e o liseto é usado para separação das frações ribossômicas com base em seu tamanho molecular, propriedades de sedimentação ou marcadores de afinidade. A abordagem resulta em material versátil utilizável para purificação e detecção imuno assistida, enriquecimento de complexos contendo fatores específicos na microscopia eletrônica. Após bloqueio profundo interligado, análises baseadas em amplificação de RNA ou hibridização, sequenciamento de RNA e espectrometria de massa tornam-se possíveis.
Configure uma cultura de levedura de um litro em um agitador orbital com uma densidade óptica inicial não mais do que 0,05 unidades de absorção a 600 nanômetros e use peptone e mídia dextrose a 30 graus celsius. Configure uma centrífuga preparatória com rotor compatível e garrafas de centrífuga para pelotizar a suspensão líquida de células de levedura a 5000 G a quatro graus celsius. Mantenha registro da densidade óptica das células em crescimento.
Deve ser entre 0,6 a 0,8 unidades de absorção e 600 nanômetros no momento da coleta se a fase de crescimento exponencial for de interesse. Uma vez que as células estejam prontas, configure uma geladeira dentro do capô de fumaça química com um padeiro contendo 250 gramas de gelo de água esmagada limpa e mostre-lhe também 25 mililitros trypsin e metanol recém-adquirido estabilizado 37% solução de formaldeído dentro do capô. Despeje a última cultura celular no padeiro contendo o gelo.
Em seguida, adicione 75 mililitros de 37% de formaldeído a uma concentração final de 2,2% de peso sobre o volume agitar intensamente a mistura até que o gelo derreta. Uma vez que o gelo seja derretido, configure um temporizador por 10 minutos Depois de incubar por 10 minutos, transfira a cultura para as garrafas de centrífugas pré-resfriadas e pelota as células por centrifugação a quatro graus celsius, 5000 G por cinco minutos. Enquanto o giro é, em pré-esfriar um tubo de 50 mililitros e manter o tampão recém-preparado A contendo glicina para neutralizar qualquer formaldeído restante no gelo.
Após a centrifugação, coloque os tubos de centrífugas no gelo com o lado da pelota em contato com o gelo. Leve os tubos para dentro do capô da fumaça e descarte o sobrenatante em um recipiente de resíduos de formaldeído. Suspenda a cápsula celular de tubos antigos em 20 mililitros de tampão A usando uma stripette de 25 mililitros e transferindo para um tubo de 50 mililitros.
Coma o volume até 40 mililitros com tampão A e colete as células de lavagem por centrifugação de quatro graus celsius, 5000 G por cinco minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota celular em um tampão de 40 mililitros, que é o tampão A que não contém glicina para remover a contaminação da glicina. Pelotar as células novamente por centrifugação a quatro graus celsius, 5000 G cinco minutos.
Repita as lavagens com tampão A, mais uma vez. Descarte o supernasce e coloque a pelota no gelo. Pesar o tubo com a pelota, a massa celular molhada deve ser de aproximadamente um grama por um litro da cultura celular.
Encha o poliestireno da caixa forrada com papel alumínio com nitrogênio líquido a uma profundidade de aproximadamente três centímetros. Coloque em tubo de 50 mililitros ereto na caixa. Suspenda a pelota em 550 microliters de tampão A dois por pipetação e vórtice por 10 segundos.
Adicione 10 microliters de 40 unidades por inibidor de microliter RNase e vórtice novamente por 10 segundos. Usando uma pipeta de um mililitro, escorra a suspensão celular para os 50 mililitros dois contendo o nitrogênio líquido. Para se preparar para o próximo passo, tubos livres de núcleo de 1,5 mililitros pré-refrigerados em gelo seco e 10 mililitros de aço inoxidável.
Transfira as gotículas de suspensão de células congeladas para os frascos usando uma espátula estéril limpa. Submergir os frascos de moagem em nitrogênio líquido por um minuto, garantindo que a fase líquida permaneça acima da junção. Coloque uma fábrica de mistura cryo em 27 Hertz para agitação por um minuto.
Agitar os potes de moagem selados em 27 Hertz por um minuto no moinho de mistura. Resfrie os frascos em nitrogênio líquido como antes e agite por um minuto a mais. Transfira os frascos para a caixa de gelo contendo gelo seco junto com os tubos livres de núcleo de 1,5 mililitro.
Usando uma pequena espátula de aço, transfira os resultados em data de moagem acolchoado para os tubos. Em seguida, armazene os tubos a menos 80 graus celsius. Em dois Frascos T175, os frascos crescem hek 293 células para 60 a 70% de confluência e o soro bovino águia modificado de Dalbeko e 10% soro bovino fetal a 37 graus e 5% de dióxido de carbono.
Pelo menos três horas antes do tempo de fixação desejado, substitua a mídia do frasco T175 por precisamente 30 mililitros de mídia completa pré aquecida. Prepare uma geladeira até a borda com gelo de água esmagada e mantenha no capô da fumaça junto com os buffers necessários, também um gelo. Para esfriar as células, remova o frasco T175 da incubadora e pressione-o formalmente contra o gelo, garantindo o máximo de contato com a superfície.
Dentro de um capô de fumaça química, incline o frasco para o lado para que a mídia se colete no lado oposto às células. Pipetas 168 microliters de 37% pesaram por formaldeído de volume diretamente na mídia agrupada. Dando uma concentração final de 0,2% de formaldeído.
Misture imediatamente. Incubar os frascos no gelo por mais 10 minutos. Despeje a mídia em um recipiente de resíduos apropriado através do lado do frasco em frente às células.
Usando um stripete, pipeta em 30 mililitros da solução salina tamponada de fosfato de Dalbeko sem íons de cálcio e magnésio e, adicionalmente, contendo 50 milimolars de glicina suavemente ao lado oposto das células. Misture balançando o frasco, devolva o flash à posição horizontal e incubar por mais 10 minutos no gelo. Despeje a solução através do lado do frasco em frente à célula e adicione suavemente sete mililitros da solução EDTA padrão de 0,25% de trippsina para desapegar e suspender as células.
Incubar o frasco à temperatura ambiente por cinco, no máximo 10 minutos. Localize o frasco verticalmente e usando um stripete, colete as células separadas lavando suavemente qualquer restante das paredes do frasco e transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros no gelo. Suplemente imediatamente a solução de suspensão coletada com 20 mililitros de mídia completa e misture girando suavemente o tubo.
Pellule as células centrifugando o tubo a 100 G por cinco minutos e quatro graus celsius. A pelota de célula deve ser claramente visível. Despeje a mídia e suspenda suavemente a pelota em 10 mililitros do soro fisco tamponado de fosfato de Dalbeko sem glicina.
Centrifugar o tubo novamente a 100 G por cinco minutos e a quatro graus celsius Despeje o tampão de lavagem e suspenda novamente a pelota em 800 microliters de salina tamponada de fosfato de Dalbeko sem glicina, mas contendo magnésio e íons de cálcio. Transfira as células re-suspensas para um novo tubo de micro centrífuga de baixa proteína de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 100 G por três minutos a quatro graus celsius.
Descarte cuidadosamente o supernatante usando uma pipetter mililitro. Nesta fase, a pelota celular pode ser congelada a menos 80 graus celsius ou seguir para a etapa de lise celular. Em um gabinete de biossegurança adicione 300 microliters de tampão de lise à base de detergente não iônico, não desnaturador, e sete microliters de inibidor de arginase e misture bem por pipetar usando uma ponta mililitro.
Conecte cuidadosamente uma agulha de calibre 25 a uma seringa de um a três mililitros e enconte vigorosamente a mistura usando pelo menos sete ingestão lenta para cima e traços rápidos de escape para baixo. Descarte a seringa e a agulha na caixa afiada e repita o procedimento com uma agulha de calibre 31 e uma seringa de 0,3 mililitro. Descarte a seringa e a agulha na caixa afiada.
Centrifugar o tubo a 12.000 G por cinco minutos a quatro graus para remover os detritos celulares. Transfira o supernatante para um novo tubo de micro centrífuga de baixa proteína de 1,5 mililitro. Armazene os detritos celulares e lise a menos 80 graus celsius.
Os complexos translacionais são sensíveis à composição iônica dos buffers. A omissão do cloreto de magnésio e a adição de propriedades de alta sedimentação revogadas do EDTA, e enquanto o cloreto de cálcio resultou em melhores picos de resultado, a melhora foi marginal. Assim, selecionamos tampão um.
O peso de 2,2% por volume formaldeído preservou excelentemente os polimentos e não diminuiu o rendimento geral em comparação com 4% de peso por formaldeído de volume. Nas células mamíferas, utilizou-se uma concentração muito menor de formaldeído de 0,2% de peso em volume. Como concentrações mais elevadas resultaram em perda substancial de material poliribosomal.
15 milimães EDTA adicionados ao liseto e todos os buffers subsequentes apresentaram efeito de desestabilização distintamente menor nas frações polissômicas, derivadas das células fixas. E esse efeito foi parcialmente replicado com 50 milimães EDTA com material de células 4% fixas, resistindo, desdobrando-se melhor. O esgotamento da glicose provoca um dos efeitos inibitórios translacionais mais dramáticos e rápidos na levedura.
Tanto o nervo adicionado quanto as condições locais de desmontagem induzidas por polisso foi ligeiramente, mas evidentemente mais polisomos retidos em glicose de baixa adição. É importante ressaltar que o material polissomo das células fixas demonstra uma alta distinção entre as células famintas e não-famintas indicando a adequação da fixação do formaldeído para preservar diferenças nos processos de tradução dinâmica. Em abordagens como tacy paysake, pode ser adicionalmente perspicaz remover pequenas subunidades ribossômicas que não se acomodam bem com os rizomas completos para os quais empregamos uma ultracentrifugação de dois estágios, permitindo o isolamento de SSU, LSU, RS, diazomes resistentes rnase, DS e poliscópicos de alta ordem confirmados por microscopia eletrônica das frações fixas.
Em comparação com as células não fixas, o material das células fixas demonstrou presença elevada de labile eIF4A nas frações ribossômicas de sedimentação mais rápidas. Usando material fixo da cepa eIF4A tapi para capturar e enriquecer eIF4A contendo complexos com contas de IDG magnético, pudemos observar o enriquecimento seletivo do eIF4A em comparação com beta-actina em SSU e RS, mas não frações de LSU do segundo gradiente sobre rnase uma desmontagem. Em comparação com outros métodos de descanso translacional, a rapidez da ação formaldeída entre as membranas celulares e a natureza indiscriminada dos cross-links promete a preservação da máxima diversidade de intermediários complexos de tradução.
Nossos achados conformam a usabilidade da rápida fixação do formaldeído para estabilizar complexos altamente transitórios e a utilidade das evidências nos cenários de respostas celulares rápidas a mudanças ambientais ou condições de estresse.
