Implantar células osteossarcoma dentro do microambiente da tíbia promove metástase pulmonar. Este modelo também pode ser útil para estudar os mecanismos de metástase pulmonar ou novas terapias contra o câncer que requerem um sistema imunológico intacto. Uma vez estabelecido o tumor, a amputação é necessária para controlar a taxa de metástase em estudos de sobrevivência de longo prazo.
Usamos as injeções jugulares para permitir a visualização da entrega de drogas intravenosas. A injeção de veia jugular é útil para muitos outros modelos de doenças para os quais é necessário um parto preciso de medicamentos. Usamos este método para fornecer nanopartículas e liganos radiolabeled para imagens in-vivo.
Aconselhamos novos usuários a praticar a remoção de um membro de cinco a 10 ratos eutanizados antes de tentar um experimento para dominar a mecânica da amputação de membros sem perda de sangue. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo peniano, fixe o rato anestesiado em um nariz em uma almofada de calor de baixo calor na posição supina. Remova o cabelo da perna direita, até o abdômen inferior ventral e dorsal.
Use gaze ou spray para desinfetar a área cirúrgica com 70% de etanol e um antisséptico diluído apropriado e aplicar pomada nos olhos do animal. Usando um movimento semelhante a uma broca para fazer uma abertura, insira uma agulha de calibre 22 marcada 10 milímetros da ponta 10 milímetros na diáfise da tíbia no meio do planalto tibial, estendendo a agulha através da metafise para a difásise. Depois de remover a agulha, misture suavemente a suspensão da célula tumoral de interesse para obter uma suspensão celular homogênea, e carregue 7,5 x 10 para o quarto das células em 20 microliters de PBS em uma seringa Hamilton.
Marque a seringa Hamilton com células a 10 milímetros da ponta da agulha e insira a agulha à marca de 10 milímetros no orifício feito pela agulha de calibre 22. Em seguida, descarregue suavemente todo o volume de células na cavidade da medula, e coloque o rato em uma gaiola em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Para a administração da doxorubicina intravenosa, após a confirmação da anestesia, use dissecção cuidadosa para visualizar a veia jugular direita ou esquerda e insira a agulha no tecido muscular sobredisto.
Direcione a agulha em direção à cabeça para o lúmen da veia jugular, como é visualizado na veia jugular anterior ao músculo peitoral, e desenhe um pequeno volume de sangue na ponta da agulha para confirmar uma inserção precisa. Quando a agulha estiver no lugar, injete lentamente de 100 a 150 microlitres de dois miligramas por quilograma de doxorubicina ao longo de um minuto. A solução deve ser visível dentro da veia durante o parto.
Quando toda a solução tiver sido entregue, use gaze estéril para aplicar pressão suave na veia e use de três a quatro clipes de ferida para fechar a incisão. Após confirmar a sedação, retire o cabelo da perna direita, até o ventral e o abdômen inferior dorsal, e coloque o rato na posição supina em uma almofada de aquecimento. Esfregue a pele do meio do bezerro até um pouco acima da articulação do quadril do abdômen inferior direito como demonstrado e aplique pomada nos olhos do animal.
Usando luvas e instrumentos estéreis, puxe a perna através da ventilação da cortina cirúrgica estéril e faça uma incisão cutânea circunferencial apenas proximal ao sufocamento. Deglove o membro traseiro para expor a artéria femoral e a veia na superfície ventral-medial do membro traseiro, e use suturas absorvíveis 4-0 para litigar os vasos ao nível do fêmur médio e transecte distally. Fixar a veia distally para reduzir o vazamento durante a dissecção muscular e usar dissecção contundente para sequestrar a articulação do quadril com rotação lateral para fora.
Localize e desarticula a cabeça do fêmur do acetábulo, e remova qualquer tecido restante, mantendo a perna presa ao corpo. Administre um bloco de respingos no acetábulo e no nervo ciático com aproximadamente seis miligramas por quilograma de ropivacaína, e use uma simples sutura absorvível interrompida 4-0 para fechar a musculatura sobre o acetábulo. Em seguida, use clipes de ferida colocados de cinco a 10 milímetros para fechar as bordas da pele.
A imagem de raio-X para vigilância tumoral permite a confirmação da invasão de tumores ósseos e pode ser realizada em membros recentemente amputados ou fixos de formalina. A imagem de raios-X também permite a avaliação da morfologia radiográfica dos pulmões com e sem metástases, fornecendo um método rápido e fácil para determinar a necessidade de eutanásia para evitar mortes espontâneas desnecessárias. No osteossarcoma do rato, a morfologia tumoral osteolítica e osteoblástica pode ser confirmada pela histopatologia do membro amputado.
Observe que o osso cortical está ausente neste exemplo e que o osso adjacente foi substituído ou fortificado por um novo osso tecido que é orientado perpendicular ao eixo existente do córtex. Ilhas de osteoides imaturos também podem ser identificadas dentro do tumor. Nessas imagens, pode-se observar a morfologia microscópica de metástases pulmonares representativas, algumas com embolia óssea mineralizada e tumoral.
A imunossuagem de tumores osteossarcoma primários pode revelar infiltração dos tumores por populações de células imunes, como macrófagos CD68 positivos ou células T CD3 positivos. A mancha ocidental de proteínas tumorais pode ser usada para determinar a expressão de quinases proteicas, receptores de proteína quinase e outras proteínas que interagem com essas vias. Para a implantação da tibial, uma vez que o primeiro orifício tibial tenha sido feito, continue a segurar a perna em sua mão não dominante no mesmo ângulo para manter a pele e os orifícios ósseos alinhados para facilitar a inserção da agulha Hamilton.
Para injeção jugular, insira a agulha no músculo, mas não angulou muito a agulha para evitar a falta da veia. Para a amputação, pratique a desarticulação em ratos eutanizados primeiro.
