Nosso protocolo permite uma identificação eficiente de combinações genéticas ou genéticas que bloqueiam a invasão do câncer no espectador. sobre a cultura não requer instalações de animais avançadas para manutenção. Como um todo, como uma biblioteca especial genérica ou geral pode ser exibida em questão de várias semanas no espectador.
Isso sobre o sistema de triagem ajudará os pesquisadores a descobrir novos alvos genéticos terapêuticos ou combinações de alvos genéticos que podem ser usados para bloquear a metástase do câncer. Para injeção intravenosa, concentram as células de 0,5 a 1 milhão de células por mililitro, usando o PBS 1X gelado para diluir ou re-suspender as células. Espere que aproximadamente um mililitro de suspensão celular seja necessário para cada 10 embriões.
Para montar o aparelho de injeção, monte uma agulha na seringa e, em seguida, estenda a agulha da seringa com um pedaço de tubo de três a cinco centímetros de comprimento. Quebre a ponta da agulha borossilicada usando fórceps finos. Carregue a seringa com 50 a 200 microlitres da suspensão celular do câncer.
E insira a agulha de borossilicato na tubulação. Inspecione a agulha para entupimento celular e bolhas de ar. Se o entupimento celular for observado dentro do capilar, remova o capilar, suspenda as células e substitua-as por uma nova capilar.
Use o êmbolo para empurrar as bolhas. Remova a tampa da tampa e transfira o embrião sob o estereoscópio. Identifique a veia apropriada a ser injetada na superfície cam;que normalmente é apenas ligeiramente mais larga do que o diâmetro da ponta da agulha borossilica e localizada no meio do caminho entre o embrião e a parede do prato de pesagem.
Geralmente é mais fácil injetar no ponto imediatamente adjacente à bifurcação da veia. Pressione a ponta da agulha contra a parede do vaso sanguíneo e aplique pressão suave na mesma direção que o fluxo sanguíneo. Se necessário, use um cotonete para ajudar a ancorar ou estabilizar o vaso que está sendo injetado.
Pressione suavemente o êmbolo da seringa por 2 a 10 segundos até que o volume desejado seja injetado. Descarte o embrião se o sangramento excessivo ou o acúmulo de líquido claro aparecer no local da injeção. Remova a agulha da CAM e dobre suavemente o local da injeção com um cotonete para remover qualquer sangue ou células cancerígenas em excesso.
Cubra o embrião injetado no prato de pesagem com a tampa e devolva-o à incubadora. Repita o procedimento até que todos os embriões sejam injetados. Inspecione visualmente os embriões para bactérias ou contaminação por moldes ou morte.
E descartar embriões contaminados de acordo com procedimentos de descarte laboratorial. Certifique-se de que as colônias metastáticas pareçam uniformes em forma durante o primeiro um a três dias após a injeção. E identificar colônias metastáticas invasivas ou não invasivas nos dias quatro a cinco pós-injeção.
No quinto dia pós-injeção, remova os embriões da incubadora e inspecione e localize os CAMs do embrião para distribuição de colônias metastáticas. Sob o microscópio de dissecção, puxe suavemente o tecido CAM que contém a colônia metastática de interesse para cima usando fórceps finos, e corte-o com uma tesoura cirúrgica. Transfira o tecido CAM para um tubo vazio e estéril de 1,5 mililitro e feche a tampa do tubo.
Repita o procedimento de excisão até que todas as colônias de interesse sejam coletadas em tubos separados. Pique suavemente o tecido CAM em um tubo de micro centrífuga, usando uma agulha de calibre 18 estéril separada para cada colônia. Adicione 100 microliters de solução 1X de colágeno-A e incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Gire as células e o tecido CAM a 300 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Aspire a solução de colágeno-A e suspenda as células de mídia incompleta para a linha de interesse celular. Em seguida, gire as células e o tecido novamente.
Suspenda desa suspensão de células e pedaços de tecido em um mililitro de mídia completa e fator de seleção, se houver. Em seguida, transfira para um único prato de cultura de tecido de 12 poços bem. Durante as próximas uma a três semanas, monitore as células cancerígenas diariamente para crescimento e contaminação.
Quando as células atingem 70 a 80% de confluência, transfira-as para um prato de cultura de volume maior. Prossiga para o sequenciamento ou a próxima rodada de seleção, assim que os números adequados de células cancerígenas forem atingidos. Embriões que apresentam um acúmulo de células cancerígenas devido à injeção mal sucedida, podem ser vistos na maioria dos capilares.
Quando a concentração celular ideal e a duração da injeção são alcançadas, o quinto dia de células transduzidas pós-injeção deve produzir uma grande variedade de fenótipos de colônia, com a maioria das colônias invasivas como determinada pelas células cancerosas que aparecem espalhadas no tecido CAM. Atenção deve ser dada às colônias metastáticas que parecem compactas e estão localizadas longe o suficiente das colônias vizinhas que podem ser excisadas com fórceps e tesouras e um pedaço de tecido CAM. Um impacto isolado positivo na tela deve exibir o fenótipo da colônia compacta após a reinjeção.
Para a medição dos contatos dos vasos sanguíneos das células cancerosas, deve-se prestar atenção ao brilho da mancha de parede vascular e a quantidade adequada de lectinas deve ser injetada para o sinal da parede vascular. Ao tentar este protocolo evite a injeção sob ou por cima e remova o sangramento excessivo ou o acúmulo de líquido. Vários genes novos que estão conduzindo a invasão de células cancerígenas no espectador foram identificados usando essa técnica.
