Name: successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse at JoVE.com

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	<li>Gonzalez, W. 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O autor não tem nada a revelar

Técnicas de cirurgia habilidosas são essenciais para alcançar imagens de cálcio óptica in vivo bem sucedidas com microscopia em miniatura de montagem de cabeça em regiões cerebrais mais profundas, como a amígdala como descrevemos aqui. Portanto, embora este protocolo forneça uma diretriz para processos cirúrgicos otimizados de fixação de placas base e implantação de lentes GRIN, processos adicionais de otimização podem ser necessários para etapas críticas. Como mencionado na seção de protocolo, amígdala coordena em cirurgia, velocidade de fluxo de ar na etapa de fixação da placa base, configurações de aquisição de imagem (taxa de quadro, potência LED, etc.) no registro de cálcio e variáveis (peso temporal ICA, menor tempo de decomposição do evento,etc. )no processamento de dados precisam ser otimizadas.
A etapa de fixação da placa base pode ser modificada. A placa da cabeça é necessária porque ajuda a fixar a cabeça de ratos acordados durante o acessório da placa base realizado na gaiola doméstica móvel. No entanto, se a gaiola doméstica móvel não for preparada em laboratório, o sistema de anestesia de gás isoflurane é uma opção alternativa. Para esta forma alternativa, a concentração de gás isoflurane pode ser crítica. Observamos que o sinal GCaMP raramente é detectado na amígdala de camundongos sob 1,5% de isoflurane. Pelo contrário, o sinal GCaMP é detectado sob uma condição isoflurane de 0,8% e os camundongos permanecem em um estado quase acordado, mas sem movimento substancial da cabeça nesta condição. Esta condição de anestesia permite, assim, conduzir o acessório baseplate sem o uso de dispositivos adicionais, como placa de cabeça e gaiola doméstica móvel.
A fixação instável do parafuso do crânio, cimento, placa base e microscópio pode causar artefatos de movimento que podem ser corrigidos usando o algoritmo de software de correção de movimento. Acredita-se que o movimento do ventrículo lateral cause um tipo irregular de artefatos de movimento que não podem ser facilmente corrigidos com o software de correção de movimento atualmente disponível. Tais artefatos de movimento irregulares são mínimos na maioria das regiões cerebrais superficiais, como o hipocampo e o córtex. No entanto, é frequentemente detectado durante a imagem óptica na amígdala. Para superar esse problema, este protocolo sugere a implantação da lente GRIN a 50 μm de distância do local de injeção viral para o lado lateral(Figura 1C),o que melhora muito o processo de aquisição de imagens reduzindo os artefatos de movimento potenciais originados do ventrículo lateral. Embora tenhamos fixado 50 μm em relação ao local da injeção viral, a coordenada alvo para implantação da lente também pode ser definida em relação ao ventrículo lateral. Neste protocolo, argumentamos que é mais crítico direcionar precisamente o site de expressão viral para o desempenho bem-sucedido das imagens. Assim, utilizamos uma coordenada de injeção viral como referência para definir a coordenada alvo da implantação da lente. Através de ensaios repetidos, estabelecemos uma condição ideal que permitiu que a lente GRIN mirasse eficientemente o local de expressão viral, evitando artefatos de movimento causados pelo movimento do ventrículo lateral. Eventualmente, o método que pode corrigir eficiente e com precisão quaisquer artefatos de movimento seria de grande ajuda para acessar imagens ópticas para regiões cerebrais mais profundas no futuro.
Embora a imagem de cálcio óptico in vivo com microscópio em miniatura de montagem de cabeça seja uma ferramenta poderosa e tenha sido otimizada, ainda há espaço para melhorias em muitos aspectos. Este protocolo facilitará estudos que visam investigar a atividade neural em tempo real na amígdala de animais que se comportam livremente.

O cálcio é um segundo mensageiro onipresente, desempenhando um papel crucial em quase todas as funções celulares8. Nos neurônios, o potencial de ação de disparo e a entrada sináptica causam rápida mudança de livre intracelular [Ca2+]9,10. Portanto, o rastreamento de transintes de cálcio oferece uma oportunidade de monitorar a atividade neuronal. GeCIs são ferramentas poderosas que permitem o monitoramento [Ca2+] em populações celulares definidas e compartimentos intracelulares11,12. Entre muitos tipos diferentes de indicador de cálcio à base de proteína, o GCaMP, uma sonda Ca2+baseada em uma única molécula de GFP13,é a GECI mais otimizada e, portanto, amplamente utilizada. Através de várias rodadas de engenharia, uma série de variantes de GCaMP foi desenvolvida12,14,15,16. Utilizamos um dos GCaMPs recentemente desenvolvidos, GCaMP7b, neste protocolo16. Os sensores GCaMP contribuíram muito para o estudo das funções do circuito neural em uma série de organismos modelo, como imagens de transientes Ca2+ durante o desenvolvimento17, imagem in vivo em uma camada cortical específica18,medição da dinâmica do circuito no aprendizado de tarefas motoras19 e imagem da atividade do conjunto celular relacionada com memória de medo associativo no hipocampo e amígdala20,21.
A imagem óptica de GECIs tem várias vantagens22. A codificação genética permite que os GECIs sejam expressos por um longo período de tempo em um subconjunto específico de células definidas por perfil genético ou padrões específicos de conectividade anatômica. A imagem óptica permite o monitoramento simultâneo in vivo de centenas a milhares de neurônios em animais vivos. Alguns sistemas ópticos de imagem foram desenvolvidos para imagens in vivo e análise de GECIs dentro do cérebro de camundongos que se comportam livremente com microscópios de fluorescência miniaturizada de montagem da cabeça21,23,24,25. Apesar da técnica de imagem óptica in vivo baseada em GECIs, lente GRIN e um microscópio em miniatura de montagem de cabeça ser uma ferramenta poderosa para estudar a ligação entre a atividade do circuito neural e o comportamento, aplicar essa tecnologia à amígdala tem sido difícil devido a vários problemas técnicos relacionados com o direcionamento da lente GRIN para células expressando GECIs na amígdala sem causar artefatos de movimento que reduzem severamente a qualidade da aquisição de imagens e encontrar células expressas gecIs. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para procedimentos cirúrgicos de fixação de placa base e implantação de lentes GRIN que são etapas críticas para o sucesso da imagem óptica de cálcio in vivo na amígdala. Embora este protocolo tenha como alvo a amígdala, a maioria dos procedimentos descritos aqui são comumente aplicáveis a outras regiões cerebrais mais profundas. Embora este protocolo seja baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), o mesmo propósito pode ser facilmente alcançado com outros sistemas alternativos.

<table><tbody><tr><td>26G needle</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&amp;alpha;-GFP</td><td>custom made</td><td></td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink)</td><td>Lang</td><td>1334-pink</td><td>Surgery &amp;amp; Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Air flow manipulator</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Baseplate</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Baseplate cover</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Behavioral apparatus (chamber)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Testcage</td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Behavioral apparatus (software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Freeze Frame</td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Carbon cage</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Data processing software</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Data Processing Software</td><td>Baseplate Attachment &amp;amp; Behavior test</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Drill bur</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Glass needle</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Head plate</td><td>Neurotar</td><td>Model 5</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Hex-key</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Laptop computer</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Surgery &amp;amp; Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microscope gripper</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Microscope, DAQ software, hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Baseplate Attachment &amp;amp; Behavior test</td></tr><tr><td>Mobile homecage</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Moterized arm</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Moterized arm software</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NI board</td><td>National instrument</td><td></td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Removable epoxy bond</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Resin cement (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C&amp;amp;B</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Skull screw</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic electrode holder</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Baseplate Attachment</td></tr></tbody></table>

successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse

O monitoramento in vivo em tempo real das atividades neuronais em animais em movimento livre é uma das principais abordagens para ligar a atividade neuronal ao comportamento. Para isso, uma técnica de imagem in vivo que detecta transitórios de cálcio em neurônios usando indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), um microscópio de fluorescência miniaturizada e uma lente de índice de refração gradiente (GRIN) foi desenvolvida e aplicada com sucesso em muitas estruturas cerebrais1,2,3,4,5,6. Esta técnica de imagem é particularmente poderosa porque permite imagens simultâneas crônicas de populações celulares geneticamente definidas por um período de longo prazo até várias semanas. Embora útil, essa técnica de imagem não tem sido facilmente aplicada às estruturas cerebrais que se localizam profundamente dentro do cérebro, como a amígdala, uma estrutura cerebral essencial para o processamento emocional e a memória do medo associativo7. Existem vários fatores que dificultam a aplicação da técnica de imagem na amígdala. Por exemplo, artefatos de movimento geralmente ocorrem com mais frequência durante a imagem realizada nas regiões cerebrais mais profundas porque um microscópio de montagem de cabeça implantado nas profundezas do cérebro é relativamente instável. Outro problema é que o ventrículo lateral está posicionado perto da lente GRIN implantada e seu movimento durante a respiração pode causar artefatos de movimento altamente irregulares que não podem ser facilmente corrigidos, o que dificulta a formação de uma visão de imagem estável. Além disso, como as células da amígdala são geralmente silenciosas em um estado de repouso ou anestesiado, é difícil encontrar e concentrar as células-alvo expressando GECI na amígdala durante o procedimento de base para imagens posteriores. Este protocolo fornece uma diretriz útil para como direcionar eficientemente as células expressando GECI na amígdala com microscópio miniaturizado de montagem de cabeça para imagens de cálcio in vivo bem sucedidas em uma região cerebral tão profunda. Nota-se que este protocolo é baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), mas não restrito a ele.

Validação da implantação das lentes GRIN Antes de anexar cronicamente a placa base ao cérebro por cimentação, a implantação da lente GRIN precisa ser validada. Em animais com implantação bem sucedida de lentes, tanto células expressas GCaMP quanto vasos sanguíneos foram claramente observados dentro de uma faixa de plano focal determinada pela distância entre lente objetiva de microscópio e lente GRIN implantada(Figura 2A e B). Em contraste, em animais com implantação fora do alvo, uma imagem clara das células expressas GCaMP não foi observada dentro da faixa de plano focal (fora de foco ou fora de vista). No caso de vasos sanguíneos fora de foco e bem focalizados poderiam ser observados, mas apenas imagens embaçadas para células dentro da faixa de plano focal(Figura 2C e D). No caso de fora da vista, os vasos sanguíneos não foram observados na maioria dos casos e nenhum sinal de fluorescência foi detectado dentro da faixa do plano focal(Figura 2E). Além disso, ao contrário de outros casos, a lente GRIN implantada mostrou uma borda brilhante (Figura 2F). O acessório baseplate é realizado apenas em animais validados com implantação de lente GRIN no alvo.
Gravação de sinais GCaMP no neurônio de LA em resposta a estímulos auditivos Neste protocolo, 4 instâncias de tom pseudorandomizado (2,8 kHz, 200 ms de duração, 25 pulsos) foram apresentadas a um mouse, e sinais GCaMP foram registrados opticamente nas células de LA de camundongos com microscópio de montagem de cabeça. Foram utilizados camundongos injetados com AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE na amígdala lateral unilateral para a imagem. Em animais com implantação bem sucedida de lentes GRIN, as células expressas por vírus e vasos sanguíneos foram claramente observadas dentro da faixa de plano focal(Figura 3A). Na condição de comportamento, aproximadamente 50-150 células geralmente apresentavam uma mudança significativa de fluorescência no campo de visão na LA mesmo sem tom como mostrado na imagem ΔF/F, provavelmente células espontaneamente ativas(Figura 3B). Após a apresentação do tom, apenas algumas células apresentaram uma alteração específica do sinal GCaMP, conforme determinado pela análise de imagem ΔF/F (6 células na Figura 3C e Figura 3D). Os mesmos procedimentos foram realizados em camundongos injetados com AAV2/1-CaMKIIα-GFP como controle. Embora as células expressas de GFP tenham sido detectadas dentro da faixa do plano focal, nenhuma célula apresentou uma mudança significativa de fluorescência com ou sem tom determinado pela análise de imagem ΔF/F(Figura 3E e Figura 3F).
Para verificação histológica da expressão GCaMP e direcionamento da lente GRIN, seções coronais do cérebro pós-morte são examinadas sob o microscópio de fluorescência(Figura 4A e Figura 4B). A coloração da DAPI é usada para confirmar células intactas e nenhum sinal de dano tecidual devido à inflamação do tecido cerebral ao redor da lente GRIN(Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig1.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático e diagramas para cirurgia estereotipada para imagem de cálcio microendoscópica in vivo no LA. (A) Um fluxo de trabalho esquemático de imagem de cálcio microendoscópica in vivo no LA. (B) Uma imagem microscópica mostrando coordenadas bidimensionais de locais de craniotomia para a injeção do vírus e a cirurgia de implante de lentes GRIN. Dois parafusos do crânio e a lente formam um triângulo equilátero. (C) Um diagrama para a posição relativa entre o local de injeção do vírus e a lente GRIN implantada, e explicação esquemática para o cálculo do "Valor A". (D) Seção transversal da camada de cimento da superfície do crânio até a placa da cabeça nos passos finais da cirurgia. O cimento dental de resina deve cobrir a parede dos parafusos e a lente GRIN implantada. O cimento acrílico é aplicado no cimento dentário de resina. A placa está presa na camada de cimento. O filme de parafina cobre a superfície da lente GRIN implantada e protege-a da poeira. Ligação epóxi removível impede o descolamento do filme de parafina. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig2.jpg"> Figura 2: Validação da implantação da lente GRIN e configuração de camadas de cimento após o acessório da placa base. (A) Uma imagem de instantâneo endoscópica representativa de animais com implantação bem sucedida de lentes GRIN. Ambas as células expressas GCaMP e vasos sanguíneos são claramente observados. (B) Imagem instantânea da superfície da lente GRIN implantada de animais com implantação bem sucedida de lentes GRIN. (C) Uma imagem de instantâneo endoscópica representativa de animais com implantação de lentes GRIN fora de foco. (D) Imagem instantânea da superfície da lente GRIN implantada de animais com implantação de lentes GRIN fora de foco. No caso de fora de foco, os vasos sanguíneos às vezes são claramente observados, mas apenas imagens embaçadas para células dentro da faixa do plano focal. (E) Uma imagem de instantâneo endoscópica representativa de animais com implantação de lentes GRIN fora de vista. No caso de fora da vista, os vasos sanguíneos não são observados na maioria dos casos e nenhum sinal de fluorescência é detectado dentro da faixa do plano focal. (F) Uma imagem instantânea da superfície da lente GRIN implantada de animais com implantação de lentes GRIN fora de vista. Ao contrário de outros casos, a borda brilhante é observada neste caso. (G) A configuração de camadas de cimento para fixação de placa base. Placa base e placa são anexadas por cimento acrílico. Deve haver um espaço não preenchido com cimento acrílico entre a placa base e a lente GRIN. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig3.jpg"> Figura 3: Gravação de sinais GCaMP nos neurônios de Los Angeles. (A a C) Dados obtidos de um mouse injetado com AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE. (A) Uma imagem de instantâneo endoscópica representativa durante um teste de comportamento. GCaMP7b expressando células e vasos sanguíneos foram claramente observados dentro da faixa do plano focal. (B) Uma imagem de instantâneo representativa mostrando o sinal ΔF/F. Linha branca indica células que apresentaram uma mudança significativa de fluorescência na região de interesse durante o teste de comportamento. Barra de escala = 50 μm. (C) Imagem de projeção de intensidade máxima. No total, 6 células apresentaram uma alteração específica do tom do sinal GCaMP. Barra de escala = 50 μm. (D) Traços representativos ΔF/F de células responsivas de tom. Cada cor corresponde a cada célula individual com a mesma cor no painel (C). (E e F) Dados obtidos de um mouse injetado com AAV2/1-CaMKIIα-GFP. (E) Uma imagem de instantâneo endoscópica representativa durante um teste de comportamento. As células expressas do GFP foram claramente detectadas dentro da faixa do plano focal. (F) Uma imagem de instantâneo representativa mostrando o sinal ΔF/F. Barra de escala = 50μm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig4.jpg"> Figura 4: Verificação histológica da posição da lente GRIN e expressão GCaMP7b. (A) Uma imagem de seção coronal representativa mostrando a expressão GCaMP7b no LA. Barra de escala = imagem ampliada de 200μm. (B). Barra de escala = 50 μm. (C) Imagem microscópica de fluorescência mostrando sinal de coloração DAPI. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61659/61659fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fator</td>
			<td>Valor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fator de amostragem de descida espacial</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fator amostral de baixa temporal</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filtro espacial: Alto corte</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Filtro espacial: Low cut-off</td>
			<td>0.005</td>
		</tr>
<tr>
<td>Correção de movimento: Corte alto</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Correção de movimento: Corte baixo</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Correção de movimento: Maxtranslation</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quadro de referência ΔF/F</td>
			<td>Quadro médio</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: blocoSize</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: convergênciaEssem</td>
			<td>1x10^-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: Peso icaTemporal</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: numICs</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: numPCs</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: unmixType</td>
			<td>Temporal</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detecção de Eventos: Constante de Decadência</td>
			<td>1.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detecção de Eventos: Limiar</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista de variáveis para processamento de dados

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Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

A imagem microendoscópica de cálcio in vivo é uma ferramenta inestimável que permite o monitoramento em tempo real das atividades neuronais em animais de comportamento livre. No entanto, aplicar essa técnica à amígdala tem sido difícil. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para atingir com sucesso células de amígdala com um microscópio miniaturizado em camundongos.

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K visualizações.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). A imagem microendoscópica de cálcio in vivo é uma ferramenta inestimável que permite o monitoramento em tempo real das atividades neuronais em animais de comportamento livre. No entanto, aplicar essa técnica à amígdala tem sido difícil. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para atingir com sucesso células de amígdala com um microscópio miniaturizado em camundongos.

Vídeo: Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologia

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Neurociência

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Imagem de cálcio de dois fótons e campo amplo no colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor em destaque: Revelando a codificação neural e os mecanismos de processamento visual no colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Imagens em tempo real para atividade de neurônios em células do giro dentado de camundongos 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

Autor em destaque: Investigando a atividade neural de células granulares do giro dentado com microscópio em miniatura

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

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In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos