Name: combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus
Uploaded: 2020-09-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus at JoVE.com

Este trabalho é financiado pela CBS Bridging Grant concedido à OOM. OOM, PAA e AS projetaram o estudo e realizaram os experimentos. As e PAA analisaram os resultados. OOM e PAA prepararam o manuscrito. Agradecemos ao Dr. Karl Disseroth (Universidade de Stanford) por disponibilizar o AAV para nosso uso.

Todos os procedimentos experimentais e de manejo animal foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Louisiana.
1. Animal experimental
<ol><li>Use ratos de 5 a 6 semanas.</li>
	<li>Casa 3-5 animais por gaiola sob condições padrão de 12 h alternando luz e ciclo escuro. Comida e água devem ser fornecidas ad libitum.</li>
</ol>2. Craniotomia e preparação animal
NOTA: Esta seção descreve procedimentos pré e peri-operatórios para craniotomia do rato. Use aparelhos estereotáticos padrão e coordenadas apropriadas (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML e Dorsoventral: DV). Consulte um atlas cerebral de rato para determinar as coordenadas para a região cerebral de interesse.
<ol><li>Anesthetize camundongos por cetamina intraperitoneal (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) injeção de coquetel. Realize um teste de beliscão do dedo do pé para garantir a ausência de sensação antes do início da cirurgia. NOTA: Alternativamente, a anestesia isoflurane com uma câmara de nariz apropriada também pode ser usada para esta etapa.</li>
	<li>Conserte suavemente a cabeça do animal no aparelho estereotaxico. NOTA: É importante lidar com animais com cautela durante este processo. Além disso, verifique a taxa de respiração e outros sinais vitais antes de prosseguir com a cirurgia. Deixe o animal descansar por ~7 minutos para reduzir o estresse.<ol>
<li>Coloque uma almofada de aquecimento na estrutura estereotaxa de tal forma que o corpo do animal esteja deitado sobre ele. Isso ajudará a manter a temperatura corporal e manter o animal aquecido, embora o procedimento. Mantenha a almofada de aquecimento para cuidados pós-operatórios e recuperação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um cortador para remover o cabelo sobre o couro cabeludo e limpe a pele com uma solução de iodo.<ol>
<li>Aplique lidocaína tópica para bloquear a sensação no couro cabeludo.</li>
		<li>Use um bisturi para fazer uma incisão de couro cabeludo médio que se estenda da frontal até a região occipital.</li>
		<li>Limpe a área de incisão com solução de iodo e exponha a calvaria. NOTA: Uma pequena quantidade de 3% de solução de peróxido de hidrogênio pode ser aplicada para remover periosteum da calvária. Isso aumentará a visibilidade de marcos (bregma e lambda) e suturas.</li>
		<li>Usando um atlas estereotático cerebral do camundongo, determine coordenadas AP e ML relativas ao bregma.</li>
		<li>Para injeção de VTA, posicione uma seringa de agulha de ponto contundente ultrafina (por exemplo, seringa neuros) nas coordenadas AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm em relação ao bregma.</li>
		<li>Use uma ferramenta de perfuração para furar um orifício de 1 mm (craniotomia) no crânio na coordenada AP/ML marcada. NOTA: Esta etapa requer um nível significativo de cautela. A pressão mínima deve ser aplicada durante a perfuração para evitar que a broca esmague o tecido cerebral. No presente estudo, a broca foi de 0,8 mm e a velocidade da broca foi fixada em 15.000 rpm. ATENÇÃO: Se o peróxido de hidrogênio foi usado na limpeza da incisão ou calvária, garanta a remoção total da solução ou permita a secura completa antes da perfuração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeção de coquetel AAV
NOTA: Esta seção descreve o processo de injeção de AAV no VTA de camundongos C57BL/6 adultos (23-27 g). O método descrito pode ser usado para injeção de AAV em qualquer região cerebral usando aparelhos estereotáticos padrão e coordenadas apropriadas. Para demonstrar este protocolo, eYFP e hChR2 foram expressos em neurônios glutamato VTA usando transfecção mediada por AAV5 sob um promotor CaMKIIα(Figura 1). A recombinação de cre-lox também pode ser usada para esta etapa.
<ol><li>Monte uma seringa com agulha de ponto contundente ultrafina (32 G; capacidade de 5 μL com precisão de 100 nL) em um injetor. Conserte o suporte de seringa em um micromanipulador. NOTA: Para este procedimento, utilizou-se um porta-seringa manual, com calibração de 1,6 nL. Um injetor automatizado também pode ser usado.</li>
	<li>Encha a seringa com água dupla destilada para limpar e testar o fluxo de fluido.</li>
	<li>Descongelar alíquotas de AAV (sorotipo 5) coquetel no gelo. Os AAVs são melhor armazenados a -80 °C para manter o título viral para uma boa expressão.</li>
	<li>Encha a seringa montada com 1.000 nL de solução AAV (10 mM em soro fisco tamponado de fosfato (PBS), pH 7.4). Dispense 10 nL da solução AAV para confirmar o fluxo do líquido antes de baixar a agulha em um local de injeção.</li>
	<li>Use um micromanipulador para baixar a agulha estereoticamente na profundidade desejada (coordenada DV). Depois de baixar a agulha para a profundidade desejada, deixe a seringa permanecer no lugar por 10 minutos antes da injeção. NOTA: Para este procedimento, a agulha foi abaixada no VTA a uma profundidade (DV) de 4,5 mm da superfície pial do cérebro. Para outras áreas cerebrais, use a coordenada dorsoventral apropriada (consulte o atlas cerebral do camundongo).</li>
	<li>Injete 600-800 nL de AAV no VTA. O volume de injeção pode ser ajustado dependendo do tamanho do local alvo.<ol>
<li>Entregar a solução AAV à taxa de 60 nL/min (intervalo de 3 min).</li>
		<li>Para expressar eYFP e hChR2 em neurônios e projeções de glutamato VTA, injete AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP. NOTA: O método de recombinação de Cre-lox também pode ser usado dependendo do objetivo do experimento.</li>
		<li>Deixe a agulha permanecer no lugar por 15 minutos após a injeção de AAV. Isso reduzirá a difusão e o backflow.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a agulha da seringa e, em seguida, suturar a incisão para fechar a ferida.</li>
	<li>Administre antibióticos e analgésicos como parte dos cuidados pós-operatórios. Coloque o mouse em uma plataforma acolchoada quente e monitore o animal até acordar. NOTA: Após 3 semanas de injeção, a expressão AAV pode ser observada pela detecção de fluorescência de proteína repórter (eYFP) em seções cerebrais de camundongos. Além disso, experimentos de fotostimulação podem ser realizados após 3 semanas(Figura 2).</li>
</ol>4. Configuração para gravações neurais in vivo com optogenética
NOTA: Esta seção descreve os passos para gravação neural aguda com o rastreamento optogenético de um circuito cerebral (projeção de neurônio glutamato VTA para o CA1). Se necessário, verifique o sistema (amplificador e conexões) para problemas de ruído elétrico e aterramento antes de iniciar esta etapa. Realizar esta etapa em uma gaiola faraday pode ajudar a eliminar o ruído elétrico na gravação.
<ol><li>Às 3 semanas após a injeção de AAV, anesthetize camundongos por injeção de uretano intraperitoneal (0,2 mg/kg). ATENÇÃO: O uretano é cancerígeno e deve ser manuseado com cautela enquanto usa equipamento de proteção. Além disso, administrar anestesia de uretano nesta concentração não é sobrevivência.</li>
	<li>Fixar a cabeça do animal em um quadro estereotático como descrito anteriormente (etapa 2.2, Figura 3A). Faça uma craniotomia para expor a dura (Figura 3A). Use uma ferramenta de perfuração (tamanho de bit: 0,8 mm, velocidade: 15.000 rpm) para remover parte do osso parietal.<ol>
<li>A craniotomia deve ter cerca de 3 mm x 4mm de largura. Aplique gotas de fluido cerebrospinal artificial (aCSF) sobre esta área para evitar o ressecamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecção (digital), use uma ponta de agulha dobrada (27 G) para extiridar a dura exposta. Tenha cuidado para não separar a delicada cobertura de pial e tecidos cortical nesta área.</li>
	<li>Furar o osso occipital (tamanho do bit: 0,8 mm, velocidade: 10.000 rpm) para segurar o parafuso moído (parafuso Phillips da cabeça da panela; M0,6 x 2,0 mm).</li>
	<li>Conecte um fio moído de aço inoxidável. NOTA: Outros tipos de fios também podem ser usados(Figura 3b).</li>
	<li>Para fotostimulação combinada (VTA) e gravação neural (CA1), use um aparelho estereotaxista multi-trilho equipado com micromanipuladores ultrafinas (10 μm ou 1 μm). Monte a fibra óptica e a sonda neural de gravação em micromanipulador de alcance de 10 μm e 1 μm de alcance, respectivamente.<ol>
<li>Se necessário, use um adaptador de teste de estágio da cabeça(Figura 3c). NOTA: No protocolo atual, um estágio de cabeça de 32 canais foi equipado com um adaptador para conter um eletrodo de gravação de 4 canais(Figura 3d). O fio moído de aço inoxidável foi soldado à porta de conexão terrestre do adaptador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nas coordenadas AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abaixe a fibra óptica de 400 μm de diâmetro no VTA.<ol>
<li>Antes de baixar a fibra óptica, conecte a ferrule a um cabo de fibra óptica (com aço inoxidável ou ferrule cerâmico) ligado a uma fonte LED acoplada a fibra. NOTA: Certifique-se de que a intensidade da luz e o foco estão definidos conforme desejado. A escolha da fonte de luz LED deve corresponder às opsinas que estão sendo direcionadas. Aqui, um driver LED de 470 nm (luz azul) foi usado para fotoativação hChR2(Figura 4a).</li>
		<li>Para sincronizar o pulso de luz com a gravação neural, conecte o driver LED e o controlador de gravação digital in porta a um pulsar de lógica transistor-transistor (Figura4b). Isso pode ser conseguido usando um divisor BNC. NOTA: O uso de um pulsar TTL proporciona a flexibilidade de definir digitalmente a frequência e duração do trem de pulso desejados. No protocolo atual, pulsos de luz de 10 ms foram acionados a 50 Hz18. Para o controle TTL do driver LED, mude o motorista para "acionamento". Neste modo, a intensidade da luz pode ser regulada girando o "botão". A frequência de estimulação pode ser ajustada para acomodar variáveis experimentais e pode variar de 1 a 100 Hz. Para rastreamento de circuito neural, recomenda-se uma frequência de estimulação de >20 Hz.</li>
		<li>Ajuste o botão para determinar a intensidade efetiva que pode gerar uma resposta sem produzir artefatos fotoelétricos. Se necessário, reposicione a fibra óptica para eliminar artefatos19. NOTA: O driver LED usado para o protocolo atual produz potência leve de ~21,8 mW.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gravação neural
<ol><li>Use uma sonda neural aguda com uma haste de 15 a 50 μm de espessura, medindo pelo menos 5 mm de comprimento. NOTA: A gravação de estruturas cerebrais profundas exigirá sondas neurais com uma haste mais longa. No presente estudo, foi utilizada uma sonda com comprimento de haste de 20 mm.</li>
	<li>Conecte o estágio da cabeça do pré-amplificador ao controlador de gravação através de um cabo SPI (Serial Periférico Interface, interface periférica). Verifique a iluminação colorida dos LEDs nas portas do controlador de gravação. Os LEDs verdes e amarelos indicam tensão adequada na placa do amplificador conectado. Led vermelho indica um controle de estágio de cabeça de software de trabalho(Figura 5b).</li>
	<li>Utilizando um micromutor, posicione os locais de contato do eletrodo na camada celular piramida do CA1 (AP: -1,94mm, ML: +1,0mm, DV: +1,1 a 1,2mm). NOTA: A fibra óptica e o eletrodo podem ser posicionados em outras regiões cerebrais desejadas para fotostimulação e gravação.</li>
</ol>6. Configurações do amplificador e filtro
<ol><li>Conecte o sistema do amplificador do controlador de gravação a um computador através de uma porta USB 3.0. Conecte o estágio da cabeça ao amplificador usando o cabo SPI. Inicie o software do controlador. Se não estiver conectado corretamente, o sistema exibirá uma mensagem "dispositivo não encontrado".</li>
	<li>Clique em Executar para ver a atividade nos canais. Cada forma de onda é plotada como a tensão (eixo y) versus o tempo (eixo x). Dependendo da região de interesse, ajuste a tensão e as escalas de tempo para ajustar o display de forma de onda.</li>
	<li>Se apenas alguns canais estiverem ativos, desabilite canais nãouso para reduzir o tamanho do arquivo no disco de armazenamento.</li>
	<li>Defina a taxa de amostragem e as frequências de corte editando parâmetros de largura de banda no software de aquisição. Para gravação uni unitária, defina as frequências de corte superior e inferior para 300 Hz e 5.000 Hz, respectivamente. Altere a taxa de amostragem do amplificador para 30 kS/s. NOTA: Escolher uma alta taxa de amostragem produzirá um tamanho maior de arquivo.</li>
	<li>Antes de gravar, verifique a integridade dos canais de eletrodos medindo a impedância a 1.000 Hz. Isso pode ser feito lançando a função na interface do usuário (software do controlador). Um canal de trabalho deve ter um valor de impedância que varia de 0,1 a 5 MΩ.</li>
	<li>Se uma saída de áudio (alto-falante) estiver conectada à porta ANALOG OUT, ajuste o ganho e o silenciador para um som de pico ideal.</li>
	<li>Para exibir o marcador do trem de pulso TTL na gravação de pico, habilite o display para o marcador DIGITAL IN. Para gravar o carimbo de tempo do trem de pulso, habilite a exibição do canal DIGITAL IN antes do experimento principal. NOTA: Geralmente há mais de um canal "DIGITAL IN" (1 ou 2). Certifique-se de que o cabo BNC do pulsador TTL esteja conectado à porta "DIGITAL IN" selecionada para exibição no software do controlador de gravação.</li>
	<li>Para visualização em tempo real da forma de onda de pico, abra a janela do escopo de pico e defina o limiar usando o clique do mouse.</li>
	<li>Inspecione o nível de ruído monitorando o Root Mean Square (RMS in μV). Para gravação de pico limpo, é preferível que o limiar de pico neural seja de pelo menos 5x RMS.</li>
	<li>Uma vez concluída a configuração, selecione o formato de saída do arquivo. NOTA: Aqui, o pico neural ca1 foi registrado em formato .rhd. Outros formatos de arquivo (.rhs e .dat) também podem ser selecionados para corresponder aos formatos de arquivo permitidos pelo software de análise.</li>
</ol>7. Gravação e configurações optogenéticas in vivo
<ol><li>Abra o software de controle de pulso (TTL), que exibe vários parâmetros de pulso ajustáveis. Selecione a porta COM apropriada no software. Ajuste os parâmetros de pulso ajustando as configurações trem e grupo. NOTA: A condição de pulso deve ser determinada considerando variáveis experimentais e design.</li>
	<li>No software do controlador do amplificador, clique em Executar para detectar picos neurais no hipocampo ou área cerebral desejada. Se necessário, ajuste a profundidade do eletrodo para detectar neurônios viáveis e ativos.</li>
	<li>Uma vez detectada atividade de tensão extracelular, observe os picos de linha de base por 15 minutos e monitore os sinais vitais do animal. Além disso, teste o pulso de luz para detectar neurônios responsivos dentro do CA1 ou região alvo anatômica desejada. NOTA: Verifique se há artefatos fotoelétricos e elimine ajustando a intensidade da luz ou a posição da fibra óptica.</li>
	<li>Regisso da linha de base por ~10 min antes de acionar o pulso de luz na frequência desejada(Figura 5a,b). Isso permitirá a comparação das taxas de disparo ou estouro com e sem iluminação. NOTA: No presente estudo, a atividade de linha de base foi registrada por 10 minutos sem iluminação, seguida de iluminação a 50 Hz(Filme 1).</li>
</ol>8. Análise
<ol><li>Converta o arquivo .rhd em formato de saída Nex5.</li>
	<li>Nome do arquivo do processo. Arquivo Nex5 em um software de classificador offline para detectar trens rasteres e formas de onda de uma única unidade(Figura 5a-b).<ol>
<li>Selecione o canal desejado na janela de entrega. NOTA: Os dados de pico registrados continuamente podem ser visualizados em uma janela separada do OFSS. A escala de tempo também pode ser ajustada. Se um tetrode for usado, o OFSS pode ser definido para classificar os 4 canais como um tetrode.</li>
		<li>Defina o nível de tensão para extração de forma de onda de cruzamento de limiar. ATENÇÃO: Utilize um mínimo de 5x RMS para detecção adequada de picos.</li>
		<li>Detecte formas de onda e realize a classificação de picos usando o método de busca de vale (automático) ou K -means (semiautomático). Quando necessário, mescla unidades que ocupam regiões semelhantes do espaço de Análise de Componentes 3D-Principal (PCA).</li>
		<li>Exportação classificada . Nex5 arquivos para análise posterior(Figura 5c-d). NOTA: Os resultados da análise do intervalo interspique, da taxa de disparo e da taxa de estouro podem ser exportados para outras plataformas de análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Detecção de fluorescência da expressão AAV
<ol><li>Após a gravação, eutanize o animal em uma câmara isoflurane.</li>
	<li>Realizar perfusão transcárvia com PBS de 10 mM (~10 mL), seguido de paraformaldeído tamponado de fosfato de 4% (PB-PFA, ~10 mL).</li>
	<li>Remova todo o cérebro intacto e fixe-o em 4% PB-PFA por 48 h.</li>
	<li>Transfira o cérebro fixo para 4% pb-PFA contendo 30% de sacarose para criopreservação a 4 °C. Depois de 72 h, se sectionia o cérebro em um criostat e monte fatias em um slide revestido de gelatina. NOTA: No protocolo atual, foram selecionadas seções contendo a parte fechada do hipocampo (rostral) para demonstrar terminais rotulados por AAV no DG, CA3 e CA1.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

Na última década, o projeto de construções AAV avançou significativamente. Como tal, promotores mais específicos de neurônios foram incorporados em uma matriz de sorotipos AAV para uma especificação de transfecção melhorada14. Combinando genes para proteínas de fluorescência, transportadores, receptores e canais de íons, bibliotecas de AAV agora existem para imagem, neuromodulação e detecção de atividade sináptica. Em construções AAV disponíveis comercialmente, uma combinação de canais de fluoroforo e íons geneticamente codificados (opsin) permite um rastreamento neuroantomático e eletrofisiológico combinado dos circuitos neurais14,18,19. Da mesma forma, a seleção de um promotor (ou método de recombinação de cre-lox) pode permitir o rastreamento de projeções específicas do tipo neurônio dentro de um circuito. No presente estudo, este protocolo foi implantado para avaliação anatômica e eletrofisiológica das projeções neurais de glutamato VTA para o hipocampo (ca1).
Circuito neural VTA-Hippocampus
O VTA faz parte do caminho mesocorticolimbico midbrain. As projeções de VTA para as áreas cerebrais envolvidas no aprendizado de recompensa e aversão foram demonstradas extensivamente20,21,22,23,24,25. Enquanto o VTA contém neurônios de dopamina, glutamato e GABA, a população de neurônios de dopamina é anatomicamente dominante. Uma função importante do VTA na aprendizagem de aversão e recompensa é atribuída a uma projeção robusta de dopamina VTA ao núcleo accumbens e núcleo raphe dorsal22,24,25,26,27,28. Embora os neurônios de dopamina e glutamato VTA projetem para o hipocampo, a função dos terminais de glutamato VTA anatomicamente dominantes é menos estudada em comparação com os terminais de dopamina VTA no hipocampo29,30.
O protocolo atual descreve o uso de uma construção AAV5 que abriga um fluorforeiro (eYFP) e opsina controlada por luz (hChR2) para o mapeamento de terminais VTA (glutamato) expressos em CaMKIIα no hipocampo. Estudos anteriores estabeleceram que os terminais de glutamato VTA são anatomicamente dominantes no hipocampo quando comparados com os terminais de dopamina VTA29. Para demonstrar os terminais pré-sinápticos de glutamato VTA no hipocampo, o AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP foi transfectado em corpos de células neuronais VTA. Isso rotulou os corpos celulares de neurônios de glutamato VTA (dentro do VTA) e esboçou terminais de glutamato VTA dentro das camadas do hipocampo.
Embora os terminais pré-sinápticos de glutamato VTA inerçam DG, CA3 e CA1, os resultados mostram variações dependentes de camadas para essas três regiões(Figura 6a-d). No DG, os terminais de glutamato VTA rotulados AAV são anatomicamente dominantes no hilus quando comparados com a camada de célula granular. No CA3, os terminais de glutamato VTA são relativamente abundantes no estrato lacunosum quando comparados com a camada celular piramial e oriens estrato. Considerando que no CA1, os terminais de glutamato VTA inervam significativamente as camadas dendríticas (estrato oriens e radiatum) quando comparados com a camada celular piramipcional. O resultado deste estudo também demonstra que a fotostimulação dos corpos de células neuronais de glutamato VTA modulam a atividade da rede neural CA1 in vivo. A fotostimulação dos neurônios glutamato VTA levou a um aumento significativo na taxa de disparo do CA1 e na taxa de estouro durante a época de fotostimulação(Figura 7a-b). Isso concorda com a distribuição anatômica dos terminais de glutamato VTA nas camadas dendríticas do CA1 (Figura 6d), onde pode exercer efeitos sobre a codificação de informações hipocampais. Em apoio a esta observação, outros estudos mostraram que o VTA é um determinante primário da codificação da memória de trabalho hipocampal, e regula a seleção de informações a serem armazenadas em memória de longo prazo através do loop VTA-hipocampo22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Considerações técnicas
Para implementar com sucesso este protocolo, a escolha dos construtos AAV deve ser determinada com base no tipo de neurônio a ser direcionado. O pesquisador deve identificar um promotor adequado (um produto genético) que seja exclusivo do tipo neurônio a ser alvo. No presente estudo, um promotor de CaMKIIα foi usado para conduzir a expressão de eYFP e hChR2 em Neurônios expressantes caMKIIα. No entanto, um método de recombinação de cre-lox também pode ser usado. Neste caso, um AAV5 floxed duplo pode ser expresso no VTA de ratos CaMKIIα-Cre. Os métodos de expressão baseados em promotor e cre-lox também são aplicáveis a outros tipos de neurônios35,36,37.
O sistema deve ser verificado quanto a ruídos elétricos. Isso pode ser feito avaliando o RMS no escopo de pico durante uma sessão de gravação de teste. Se necessário, o sistema e o aparelho estereotático devem ser alojados em uma gaiola faraday, enquanto o solo do amplificador está conectado à gaiola. Os locais de contato com o eletrodo podem ser organizados linearmente ou um tetrode. A escolha do projeto da sonda deve ser determinada com base no objetivo do experimento. Uma matriz linear detecta neurônios em várias camadas. Sondas com várias especificações de espaçamento (em mícrons) também estão disponíveis comercialmente. O comprimento da haste e a distância entre os locais de contato da sonda devem ser considerados durante o procedimento de gravação e para a análise. Quando a configuração estiver concluída, o pulso de luz precisa ser verificado durante uma gravação de teste para eliminar artefatos fotoelétricos. Isso também pode ser otimizado ajustando a posição do eletrodo em relação à profundidade e localização da fibra óptica.
Limitações
Embora o CaMKIIα seja expresso principalmente em neurônios liberadores de glutamato, a proteína também está presente em algumas populações de neurônios de dopamina que co-liberam glutamato. Assim, o uso de AAV5-CaMKIIα irá rotular principalmente neurônios glutamato e alguns neurônios de dopamina que expressam CaMKIIα. Os protocolos de fotostimulação com LED são acessíveis e podem ser facilmente montados. No entanto, é importante notar que um protocolo de fotostimulação acionado a laser é mais eficaz38,39,40. A solução AAV injetada na mesma região cerebral para diferentes animais produz diferentes limiares de expressão. No entanto, esperar por 3 semanas ou mais após a injeção pode reduzir essa variação permitindo a transfecção ideal. A solução AAV injetada em uma região cerebral também pode se difundir para áreas cerebrais circundantes. Observar o período de espera após a redução da agulha, e entre as injeções de bolus podem reduzir a difusão da solução AAV do local da injeção.
Em resumo, este método pode ser usado para rastrear circuitos neurais no cérebro de roedores. Embora o protocolo atual descreva o rastreamento do circuito neural in vivo em camundongos anestesiados, o procedimento também pode ser implantado para gravação crônica em camundongos de comportamento acordado.

Na última década, uma série de ferramentas genéticas foi desenvolvida para aumentar a especificidade da modulação do tipo neurônio, e o mapeamento de redes neurais complexas1. Notavelmente, vírus neurotrópicos com uma capacidade inerente de infectar e replicar em células neuronais foram implantados para expressar ou ablate proteínas específicas em subtipos de neurônios. Ao abrigar proteínas de fluorescência ou indicadores de atividade sináptica geneticamente codificados, os vetores AAV transfectados rotulam e delineiam redes neurais nas regiões cerebrais2,3. A escolha de um promotor na construção AAV direciona a expressão do vetor em tipos de neurônios com algum nível de especificidade (expressãodependente do promotor). No entanto, através da recombinação de Cre-lox, os construtos AAV são implantados com maior especificidade para rotulagem de neurônios4,5,6,7. Note-se que as proteínas de opsinas microbianas fotoativadas e as proteínas de fluorescência embaladas em vetores AAV podem ser expressas em vários subtiposde neurônios 8, e são ideais para imagens, rastreamento de circuito do tipo neurônio e fotomodulação9,10.
Os AAVs constroem estereoticamente injetados em uma região cerebral (ou núcleo) impulsiona a expressão da proteína repórter nos terminais soma, dendrite e axônios. A expressão neural da AAV abrigando um gene repórter (eYFP) facilita a rotulagem de corpos celulares neurônios e o rastreamento anatômico de projeções de e para outras regiões cerebrais11,12,13,14. Os construtos AAV-eYFP que transportam opsina controlada por luz (por exemplo, hChR2), podem ser implantados como uma ferramenta para imagens6,15 e rastreamento fisiológico baseado em estimulação de projeções neurais para atingir áreas cerebrais in vivo16. Dependendo do sorotipo AAV, a direção da rotulagem de neurônios pode ser anterograda ou retrógrada11,12. Estudos anteriores estabeleceram que o AAV5 viaja anterogradavelmente em neurônios12. Assim, a fotostimulação de corpos celulares expressando hChR2 produz efeitos pré-sinápticos em outros lugares do cérebro (alvo)17.
Aqui, o AAV (sorotipo 5) com um promotor CaMKIIα foi usado para expressar eYFP (repórter) e hChR2 (opsin) em neurônios glutamato VTA e projeções axonais. Os resultados deste estudo demonstram a distribuição dependente de camadas dos terminais pré-sinápticos de VTA-glutamato nas regiões hipocampal CA1, CA3 e DG. Além disso, a fototimulação dos neurônios de glutamato VTA aumentou as taxas de disparo de ca1 multi-unidades e uni unidades in vivo quando comparada com os valores da linha de base. Este protocolo utiliza ferramentas acessíveis e softwares comercialmente disponíveis que podem aumentar a qualidade dos dados obtidos a partir de experimentos de rastreamento de circuito neural.

<table><tbody><tr><td>3% Hydrogen peroxide</td><td>Fisher chemical</td><td>H312</td><td></td></tr><tr><td>AAV-CaMKII&amp;alpha;-ChR2-eGYP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #26969</td><td></td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC Splitter</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Split Mating Sleeve for &amp;Oslash;1.25mm Ferrules.</td><td>Thorlabs</td><td>ADAL1-5</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>LR 39098</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin coated slides</td><td>Fisher scientific</td><td>OBSLD01CS</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&#039;s syringe (Neuros)</td><td>WPI Inc.</td><td>06H</td><td></td></tr><tr><td>Head stage adapter</td><td>Neuronexus</td><td>Adpt-Q4-OM32</td><td></td></tr><tr><td>High impedance silicon probe</td><td>Neuronexus</td><td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td><td></td></tr><tr><td>INTAN 512ch Recording Controller</td><td>INTAN</td><td>RHD2000</td><td></td></tr><tr><td>Iodine solution</td><td>Dynarex</td><td>1425</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Spectrum</td><td>K1068</td><td></td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>LED light source (470 nm)-blue light</td><td>Thorlabs</td><td>M470F3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M0-203</td><td></td></tr><tr><td>Optic fiber</td><td>Thorlabs</td><td>CFMLC14L05</td><td></td></tr><tr><td>Pan head philips screw (M0.6 X 2mm)</td><td>Amazon</td><td>M0.6 X 2mm</td><td></td></tr><tr><td>Pre-amplifier headstage (32 Channel)</td><td>INTAN</td><td>C3314</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Kopf</td><td>1530</td><td></td></tr><tr><td>TTL pulser</td><td>Prizmatix</td><td>4031</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61430</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Version&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>version 8</td><td></td></tr><tr><td>Intan Recording Controller</td><td>Intantech</td><td>version 2.07</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td>version 5.215</td><td></td></tr><tr><td>Plexon Offline Spike Sorter</td><td>Plexon Inc</td><td>version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ACSF Composition:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 3 KCl, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and 25 Glucose).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus

A modulação optogenética de subsu populações de neurônios no cérebro permitiu aos pesquisadores dissecar circuitos neurais in vivo e ex vivo. Isso fornece uma premissa para determinar o papel dos tipos de neurônios dentro de um circuito neural, e sua significância na codificação de informações em relação ao aprendizado. Da mesma forma, o método pode ser usado para testar a significância fisiológica de duas ou mais regiões cerebrais conectadas em animais acordados e anestesiados. O presente estudo demonstra como os neurônios de glutamato VTA modulam a taxa de disparo de neurônios piramidários putativos no CA1 (hipocampo) de camundongos anestesiados. Este protocolo emprega rotulagem dependente de adeno (AAV) de neurônios glutamato VTA para o rastreamento de terminais de glutamato pré-sináptico VTA nas camadas do hipocampo. Expressão de opsina controlada pela luz (channelrhodopsin; hChR2) e proteína de fluorescência (eYFP) abrigada pelo vetor AAV permitiu rastreamento anterograde de terminais de glutamato VTA, e fotostimulação de corpos celulares neurônios de glutamato VTA (no VTA). Eletrodos de silício agudos de alta impedância foram posicionados no CA1 para detectar respostas multi-unidades e uni unidades à fotostimulação VTA em vivo. Os resultados deste estudo demonstram a distribuição dependente de camadas dos terminais de glutamato VTA pré-sinápticos no hipocampo (CA1, CA3 e DG). Além disso, a fotostimulação dos neurônios glutamato VTA aumentou a taxa de disparo e estouro de unidades piramigráficas ca1 putativas in vivo.

Rastreamento de anterogrado
A expressão AAV foi verificada por imagens de imunofluorescência de proteína repórter (eYFP) no VTA de C57BL/6 camundongos 21 dias após a injeção(Figura 2). A rotulagem anterograda bem sucedida de projeções de glutamato VTA pré-sináptico no hipocampo também foi verificada pela detecção de eYFP nas camadas do DG, CA3 e CA1 (Figura 6a-d; Filme 2 e 3).
Projeções de glutamato VTA para o hipocampo modulam a atividade ca1
A fotostimulação dos neurônios glutamato VTA aumentou a atividade de neurônios CA1 piramidalas putativos. Isso é evidente como um aumento dos eventos de espetamento durante a fase ON light(Filme 1)quando comparado com a fase light OFF(Figura 5a-b). Para suportar esse desfecho, a comparação estatística das taxas de disparo de rede CA1 antes (luz OFF; linha de base) e após a fototimulação (light ON) revelou um aumento significativo para o período pós-estimulação (Figura 7a; p = 0,0002). A análise subsequente do trem raster para detectar rajadas (2-4 picos em <16 ms) também demonstra uma taxa de estouro aumentada para os neurônios piramidfábulos putativos cata após fototimulação de glutamato VTA(Figura 7b; p = 0,0025). A análise estatística (teste t-testedo aluno) foi realizada com software padrão. Aqui, a taxa de disparo ou estouro da linha de base (light OFF) foi comparada com os valores light ON (fotostimulação).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig1v2.jpg"> Figura 1: Ilustração esquemática da injeção AAV-CaMKII-ChR2-eYFP no VTA do mouse C57BL/6. Rotulagem anterograda de neurônios VTA e projeções axonais para o hipocampo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig2v2.jpg"> Figura 2: Imagens de fluorescência que mostram a expressão AAV-CaMKII-ChR2-eYFP no VTA e a faixa de fibra óptica. Dk: núcleo de Darkschewitsch, scp: peduncle cerebelar superior, VTA: área tegmental ventral, e RM: núcleo retromárquico. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig3v2.jpg"> Figura 3: Demonstração da craniotomia, colocação de eletrodos e colocação de fibra óptica. (A) Incisão midline expondo o crânio (b: bregma, oc: osso occipital). (B) Colocação do parafuso de aterramento (gs) no osso occipital e fio de aço inoxidável conectado (gw). (C) Posicionamento estereotático da cânula de fibra óptica (foc: cabo de fibra óptica). (D) Posicionamento estereotático da cânula de fibra óptica e pernil da sonda neural (foc: cabo de fibra óptica, adp: adaptador, ms: manga de acasalamento, prs: pernil sonda, hs: estágio da cabeça). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig4v2.jpg"> Figura 4: Conexão dividida BNC para carimbos de tempo combinados de pulsação de luz e amplificador (gatilho). (A) Demonstração da emissão de luz LED a partir da ponta de uma cânula de fibra óptica. (B) Pulso TTL através de um adaptador split BNC para controlar a gravação do LED e do amplificador de carimbo de tempo (ampl). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig5v2.jpg"> Figura 5: Trem de pico registrado continuamente (dados brutos) com detecção de unidade única. (A) Captura de tela de gravação bruta do hipocampo de um rato anestesiado. (B) Iluminação fotográfica orientada por TTL do VTA na gravação bruta. Linhas azuis claras demonstram os carimbos de tempo para períodos Light ON (λ = 470nm) e frequência de estimulação. (C-D) Unidades de trem de pico e neurônios continuamente registradas derivadas pela triagem de picos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig6v2.jpg"> Figura 6: Imagens representativas da fluorescência demonstrando a expressão de AAV-CaMKII-ChR2-eYFP no hipocampo. (A) DG (GCL: camada de célula granular, hil: hilus). (B) Parte do CA3 próximo ao DG (SL: estrato lacunosum, pira: camada celular pirana). (C) CA3 propriamente dito. (D) CA1 (assim: stratum oriens, pyr: pyramidal cell layer, rad: stratum radiculata). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61282/61282fig7v3.jpg"> Figura 7: Comparação estatística da taxa de disparo antes e depois da fototimulação. (A) Gráfico de barras demonstrando uma taxa média aumentada de disparo (Hz) para unidades de neurônios piramidários putativos no CA1 (***p = 0,0002) após a iluminação fotográfica. (B) Gráfico de barras demonstrando uma taxa de estouro aumentada para neurônios ca1 putativos após iluminação fotográfica (**p = 0,0025). Barra de erro: erro padrão de média. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/61282fig7v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme 1: Gravação de captura de tela do controlador do amplificador e do software pulser. O filme demonstra gravação de linha de base (light OFF) seguida de fotostimulação (luz ON, λ = 470 nm) que é indicada com carimbos de tempo azuis. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/Shrestha_et_al_Movie_1.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme 2 e Filme 3: Ilustração 3D dos terminais de glutamato VTA no DG de um mouse. DAPI-azul: rótulo nuclear na camada de célula granular (GCL); eYFP-Green: Terminais AAV rotulados-VTA no DG hilus. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61282/Movie_2_and_3.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esses vídeos.</a>

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Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K visualizações.  Louisiana State University School of Veterinary Medicine. O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Vídeo: Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Comportamento

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Bioquímica

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolução<em&gt; In Vivo</em&gt; Manual Protocolo Segmentação para hipocampo humano subcampos Utilizando Ressonância Magnética 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Neurociência

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Melhorar a aplicação de alto Peso Molecular Biotinylated dextrano amina para projeção Thalamocortical rastreamento em ratos

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Imagens em tempo real para atividade de neurônios em células do giro dentado de camundongos 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

Autor em destaque: Investigando a atividade neural de células granulares do giro dentado com microscópio em miniatura

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

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