Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por Subsídios do Instituto Nacional de Saúde Mental (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), bolsa de formação pré-doutorado do Instituto Nacional de Medicina Geral (T32GM007635 a S.R.), e uma Bolsa Lyda Hill Gilliam para Estudos Avançados (GT11021 a S.R.). Agradecemos ao Dr. Kevin Woolfrey pela ajuda com o microscópio, Dr. K Ulrich Bayer pelo uso de seu microscópio epifluorescente, e Thomas Südhof (Universidade de Stanford) para o plasmídeo LRRTM2.

1. Cultura celular e transfecção
<ol><li>Faça mídia celular HEK com DMEM, 1x (Modificação do Meio da Águia) de Dulbecco com glicose de 4,5 g/L, l-glutamina & piruato de sódio e 10% FBS. Filtro estéril.</li>
	<li>Ligantes e receptores adequados para agregação de pré-determinantes e receptores para ensaio de agregação. NOTA: Neurexin3α SS4+/- e um de seus ligantes conhecidos, LRRTM2, foram utilizados neste estudo. Ligantes e receptores de interesse foram expressos a partir de cDNAs em pcDNA3.1. Um conjunto Gibson foi usado para inserir Neurexin3α no pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCCTACTC/ GAGCGGCCGCCCCGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Prepare células HEK293T.<ol>
<li>Cresça células HEK293T para confluência em um frasco T-75.</li>
		<li>Uma vez confluente, use 2 mL de trippsina e coloque em incubadora de 37 °C por 2 min. Adicione 6 mL de mídia HEK ao frasco para resuspend células e transfira todos os 8 mL para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Pelota a 500 x g por 5 min e resuspend na mídia de células HEK para um total de 8 mL.</li>
		<li>Conte células e adicione 735.000 células em cada poço de uma placa de 6 poços. Ajuste o volume final para 2 mL para cada poço usando mídia de célula HEK.</li>
		<li>Coloque na incubadora de 37 °C e permita que as células cresçam durante a noite ou até atingirem 50-60% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Células HEK293T transfectas utilizando o método fosfato de cálcio13.<ol>
<li>Transfetar bem-1 com 3 μg da proteína de interesse e co-transfeto com 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg de mCherry).</li>
		<li>Transfect well-2 como na etapa 1.4.1. mas com a proteína mutante de interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfect well-3 com 3 μg do ligante de interesse e co-transfeito com 1 μg de outra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg de GFP).</li>
		<li>Transfect well-4 e well-5 para servir como controles negativos: bem-4 com 1 μg de GFP e bem-5 com 1 μg de mCherry.</li>
		<li>Prepare outra placa (como na etapa 1.4.1-1.4.4) se exigir condições ou controles adicionais (Neurexin3αWT/A687T SS4+). NOTA: A eficiência da transfecção é analisada 24 h após a transfecção sob um microscópio de epifluorescência e quantificada como o número de células expressando a proteína fluorescente com a qual foram transfecidas. Uma abordagem mais simplificada incluiria a transfecção de células HEK com uma codificação vetorial bicistrônica para uma proteína fluorescente e o ligante de interesse e é altamente recomendado acima da co-transfecção. No caso deste estudo, as neurexinas alfa são ~4,3 kb e a baixa intensidade de fluorescência foi observada usando um sistema bicistronic que necessita de co-transfecção.</li>
	</ol></li>
	<li>48 horas após a transfecção, colhe células para agregação.<ol>
<li>Lave cada poço duas vezes com PBS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 10 mM EDTA em PBS em cada poço para dissociar suavemente as interações célula-célula e incubar a placa a 37 °C por 5 minutos. NOTA: A trippsina não é recomendada para a etapa 1.5.2 devido ao potencial decote proteolítico de moléculas de adesão em estudo. Além disso, após a adição de EDTA, o protocolo pode não ser interrompido até a conclusão, pois as células serão agora expostas a condições ambientais.</li>
		<li>Bata suavemente a placa para desprender as células e colher cada poço em tubos cônicos separados de 15 mL.</li>
		<li>Centrífuga tubos cônicos a 500 x g e temperatura ambiente por 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Enquanto as células estão pelotando, prepare 6 tubos de incubação rotulando a parte superior de cada tubo de microcentrifuuagem com cada condição. NOTA: Cada permutação das condições de GFP e mCherry deve ser usada para abranger todas as condições experimentais e controles adequados. Por exemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-- mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-— mCherry/LRRTM2 — GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Faça tubos adicionais para acomodar outras condições e controles.</li>
	<li>Remova as células supernascidas e resuspend em 500 μL de mídia HEK com 10 mM CaCl2 e 10 mM MgCl2 aquecidos a 37 °C. NOTA: A adição de CaCl2 e MgCl2 permite que moléculas de adesão restabeleçam a vinculação e só é necessária se os parceiros de interação transcelular em questão exigirem cáções divalentes para adesão.</li>
	<li>Conte as células em cada tubo cônico de 15 mL usando um hemocitômetro e alíquota de 200.000 células de cada condição em tubo apropriado a partir da etapa 1.6.1 para uma mistura de 1:1 em um volume total de 500 μL. NOTA: Deve levar apenas 5 minutos por condição para contar e parcelar valores.</li>
	<li>Incubar tubos à temperatura ambiente em um rotador de tubo lento.</li>
</ol>2. Aquisição de imagens
<ol><li>Otimize parâmetros de aquisição de microscópio para amostras específicas. Neste exemplo, as imagens foram tiradas em um microscópio de campo largo. Use um objetivo de ar 5x (NA: 0,15; WD: 20000 μm) para obter um campo grande o suficiente para análise.</li>
	<li>Avalie a agregação da linha de base imediatamente após misturar as duas condições das células HEK na etapa 1.8. Estas são agora as imagens do "tempo zero".<ol>
<li>Pipeta 40 μL de cada mistura de amostra em um slide de microscópio carregado e imagem sob fluorescência nos canais 488 e 561.</li>
		<li>Adquira três diferentes campos de visão em um plano focal por gota de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquira imagens finais a 60 min como a imagem do "tempo 60".<ol>
<li>Para obter a imagem 'time 60' da mistura após uma incubação de 60 minutos, pegue outra amostra de 40 μL de cada condição a partir de tubos rotativos e pipeta cada amostra em um slide carregado. Imagem como na etapa 2.2.2. NOTA: A agregação celular deve ser verificada a cada 15 minutos até que ocorra a saturação. O tempo de agregação dependerá das proteínas que estão sendo testadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise ImageJ/Fiji
<ol><li>Para quantificar a extensão da agregação usando Fiji/ImageJ, salve arquivos de análise.<ol>
<li>Salve os arquivos de codificação suplementar fornecidos na pasta de macros imageJ no computador.</li>
		<li>Instale a macro de agregação fornecida (Plugins, Macros, Install e selecione o arquivo "AgregaçãoSsay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine limiares.<ol>
<li>Carregue um arquivo de .tif 'time zero' em imageJ e divida os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos). NOTA: A imagem 'time zero' é usada para determinar o limiar e o menor tamanho de puncta para todo o experimento.</li>
		<li>Mascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). A janela Make Mask From Image será exibida. Verifique as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e clique em OK.</li>
		<li>Determine o limiar da imagem usando a barra de slides, grave o número à direita da barra de slides e clique em OK.</li>
		<li>Um Histograma do Tamanho do Cluster aparecerá. Selecione um tamanho de cluster do histograma que se adapte ao experimento, digite este número no Tamanho do Cluster Min: caixa e clique em OK. Clusters abaixo deste tamanho não serão analisados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a análise.<ol>
<li>Abra a imagem 'time 60' da condição 1 na imagemJ e divida os canais como na etapa 3.2.1.</li>
		<li>Mascarar cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Use o mesmo limiar e tamanho determinados na etapa 3.2.3 e na etapa 3.2.4. Desmarque as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params do Histograma e digite manualmente o tamanho e os limiares nos campos apropriados e clique em OK.</li>
		<li>Calcular o índice de agregação (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selecione os canais mascarados a serem comparados e o diretório no qual os arquivos resultantes serão salvos.</li>
		<li>Repita as etapas 3.3.1-3.3.3 para cada imagem 'time 60' em cada condição. NOTA: O índice de agregação é definido como a área de sobreposição total dividida pela soma das duas áreas de canal menos a área de sobreposição multiplicada por 100 (Índice de agregação = área de sobreposição/[área do canal 1 + área do canal 2 – área de sobreposição] x 100). Esta normalização é uma operação 'OR' entre os dois canais mascarados representando os pixels totais em qualquer máscara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Dissecar as interações proteína-proteína que ocorrem em trans durante a adesão celular pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes aos processos celulares básicos, incluindo a formação, função e manutenção de sinapses durante a maturação e remodelação. As implicações das interações célula-célula se expandem além da neurobiologia e têm papéis mais amplos na transdução de sinais, migração celular e desenvolvimento de tecidos14. Aberrações na adesão celular podem interromper processos celulares imperativos para a função celular adequada e podem subjacente a uma variedade de etiologias como câncer, artrite, vício, autismo e esquizofrenia1,15,16. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado otimizado envolvendo a agregação celular HEK que permite testar interações de adesão celular em trans.
Com este protocolo de agregação celular HEK, podemos dissecar diferenças na agregação à capacidade de ligação aproximada entre uma proteína pré-sináptica e seu ligante pós-sináptico. Como tal, podemos fazer perguntas como: a interação entre duas proteínas sinápticas essenciais é afetada por uma mutação de ponto? Mais especificamente, a interação trans de Neurexin3α com LRRTM2 é afetada pelo A687T? A mutação missense A687T estudada aqui está localizada em uma região de linker não estudada anteriormente do domínio extracelular de Neurexin3α7. Os resultados ilustram que a mutação A687T aumenta a agregação de células contendo Neurexin3αA687T para células que contêm LRRTM2 (Figura 2C). Este achado é significativo porque foi demonstrado anteriormente que os LRRTMs só se ligam a Neurexins através de um domínio neurexin chamado LNS617, e sugere ainda que sequências a montante do LNS6 podem exercer um efeito independente sobre as interações trans entre Neurexin3α SS4- e LRRTM27.
Os resultados da Figura 2 exibem a especificidade deste ensaio como todos os controles negativos (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP ou LRRTM-GFP/mCherry) não teve agregação observável após 60 minutos. Um controle crítico usado neste estudo, Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, também não apresentou agregação após 60 min porque o LRRTM2 é conhecido por se ligar exclusivamente aos isoforms SS4 carecendo (SS4-) de Neurexin. Este controle demonstra que a simples superexpressão de moléculas ligadas à membrana é insuficiente para forçar a agregação neste sistema, o que ilustra ainda mais a especificidade deste ensaio.
O ensaio de adesão celular descrito aqui tem sido amplamente utilizado para testar as interações das moléculas transsinápticas de adesão celular8,18,19; no entanto, pode ser usado para testar interações adesivas célula-célula de proteínas tethered membrana. Este protocolo, que evoluiu ao longo do tempo, foi otimizado a partir do protocolo publicado original e das variações subsequentes do protocolo, alterando três parâmetros experimentais. Primeiro, a temperatura de incubação das células foi alterada. O protocolo original exige a incubação de células na etapa 1.9 a 4 °C. Essa baixa temperatura pode atuar como um estressor ambiental e pode diminuir a viabilidade celular levando à morte celular e à lise celular. Durante a lise celular, as células secretam DNA genômico e detritos celulares na mídia que faz com que as células se desprestrem em soluções que levam a falsos positivos durante a imagem. Segundo, o número de células por condição foi aumentado para 200.000 por população e o tamanho objetivo foi alterado para 5x; isso permite ao pesquisador visualizar um maior número de interações por campo de visão, a fim de aumentar o poder estatístico dentro de cada n. Três, o índice de agregação foi medido de forma diferente. Os índices de agregação anteriores foram limitados pela seleção do tamanho do cluster pelo experimentador que levou à exclusão de clusters "subtenente". Em contraste, os limiares são agora definidos para o tamanho individual da célula no 'tempo zero', e a agregação agora é calculada como a área sobreposta dividida pela soma das duas áreas de canal menos a área de sobreposição multiplicada por 100 no 'tempo 60' que permite a inclusão de clusters positivos menores tornando o ensaio mais sensível a outros pares de proteína-ligantes(Figura 2B,C).
A solução de problemas e a otimização podem ser necessárias dependendo das proteínas interativas testadas. Embora o período de incubação até a aquisição final de imagens difere dependendo das proteínas testadas, é fundamental que nenhuma agregação seja observada no 'tempo zero'. Se a agregação é vista no momento zero, pode implicar que as células não eram saudáveis para começar. Isso pode ser devido a vários fatores, incluindo exposição súbita a temperaturas abaixo de 37 °C ou procedimento experimental lento. É importante ressaltar que a mídia de resuspensão para a etapa 1.7 deve ser de 37 °C, o que permitirá que as células atinjam gradualmente a temperatura ambiente sem uma queda brusca repentina da temperatura. Uma maneira de ter a saúde celular ideal durante todo o experimento é garantir que as etapas 1.7 a 1.9 sejam concluídas dentro de um prazo de 25 minutos sem intervalos entre si. Recomenda-se que o microscópio esteja configurado e pronto para uso antes das células de colheita celular na etapa 1.5; isso garante que uma imagem verdadeira de "tempo zero" possa ser tomada imediatamente na etapa 2.2.
Se a agregação não for observada após 60 minutos de incubação, vários fatores podem estar contribuindo para essa falta de adesão. Em primeiro lugar, as proteínas em questão podem não ser parceiros vinculantes ou podem se envolver em interações de baixa afinidade não detectáveis por este ensaio. Neste caso, um ensaio mais sensível pode ser necessário.  Em segundo lugar, as proteínas de interesse podem não se localizar para a membrana quando expressas sozinhas nas células HEK. Neste caso, confirme que a proteína é localizada por meio de técnicas bioquímicas (biotintilação superficial) ou marque diretamente a proteína de interesse com uma etiqueta fluorescente e células HEK293T em 40x ou maior ampliação para avaliar a expressão superficial. No entanto, após a confirmação da localização da membrana, recomendamos o uso de variantes não-grampeadas para este ensaio de agregação de células HEK, a fim de avaliar com mais precisão a capacidade de ligação da proteína nativa. Em terceiro lugar, neste protocolo permitimos que Neurexin3α se expressasse por 48 h; no entanto, o tempo de expressão proteica pode variar dependendo das proteínas testadas. Em quarto lugar, é fundamental complementar a mídia na etapa 1.7 com MgCl2 e CaCl2 se as proteínas em questão dependerem de cára divalent, como é o caso do exemplo de Neurexins e LRRTM211. Se não se sabe se os parceiros de interação requerem cations divalent para adesão, adicione EDTA em uma condição. O EDTA deve quelatar cations de reminação naturalmente presentes no DMEM garantindo uma solução livre de cálcio e magnésio. Se a adesão for observada após a adição de EDTA, as proteínas em questão não requerem cations divalent para adesão.
Existem muitos métodos para testar interações proteicas; no entanto, a maioria não é específica para testar apenas interações trans que ocorrem de célula para célula e requerem passos tediosos de purificação de proteínas. Embora o ensaio de agregação celular HEK não seja uma medida direta de afinidade e não deva ser usado para substituir uma abordagem mais quantitativa para recuperar as constantes de dissociação, pelo que sabemos, este ensaio representa uma abordagem para testar interações trans verdadeiras de forma semi-quantitativa e relativamente eficiente. Além disso, devido à relativa facilidade deste ensaio, o ensaio de agregação celular HEK pode ser usado em conjunto com essas abordagens mais quantitativas para obter uma caracterização mais ampla e completa das interações que ocorrem.

Interações sinápticas facilitadas por moléculas de adesão sináptica são fundamentais para o desenvolvimento, organização, especificação, manutenção e função das sinapses e da geração de redes neurais. A identificação dessas moléculas de adesão celular transsináptica está aumentando rapidamente; assim, é fundamentalmente importante identificar parceiros vinculantes e entender como essas novas moléculas de adesão interagem entre si. Além disso, o sequenciamento do genoma identificou mutações em muitas dessas moléculas de adesão que estão comumente ligadas a uma infinidade de distúrbios neurodesenvolvimentos, neuropsiquiátricos e de dependência1. Mutações em genes que codificam moléculas de adesão celular sináptica podem alterar prejudicialmente interações trans e podem contribuir para alterações fiofoficológicas na formação e ou manutenção da sinapse.
Existem ensaios múltiplos para avaliar quantitativamente interações proteína-proteína, como calrómetria isotérmica, dicromaísmo circular, ressonância de plasmon superficial2 e, embora quantitativa na natureza, eles têm várias limitações. Primeiro, eles requerem proteína recombinante, às vezes exigindo passos longos e tediosos de purificação. Em segundo lugar, exigem equipamentos especializados sofisticados e conhecimentos técnicos. Em terceiro lugar, eles podem superestimar a extensão da ligação, pois permitem interações cis e trans entre proteínas que são naturalmente amarradas a uma membrana in vivo. Aqui propomos um ensaio simples e relativamente rápido que testa exclusivamente interações trans.
Para contornar muitas das complicações associadas a ensaios proteicos purificados, otimizamos um ensaio de interação proteica baseado em células que recapitula interações trans em um sistema celular heterologos reduzido. Este ensaio tem sido usado anteriormente de várias formas para estudar interações transcelulares. Nesta abordagem, moléculas de adesão celular candidatas são transfectadas em células HEK293T. Em condições fisiológicas, as células HEK293T não apresentam auto-agregação, tornando-as modelos exemplares para este ensaio. No entanto, quando populações individuais de células HEK expressando receptor e ligante são combinadas, a ligação do receptor e do ligante força a agregação de células HEK a ocorrer. Esta agregação é mediada exclusivamente por interações trans e geralmente é observável em dezenas de minutos. Não são necessárias etapas de purificação de proteínas neste método, e a eficiência do método baseia-se no paradigma de que populações de células HEK expressando moléculas de adesão cogna estão sendo combinadas e, em seguida, imagens apenas dezenas de minutos depois. Além disso, este método é relativamente barato, pois nem anticorpos nem equipamentos caros são necessários. O único equipamento necessário para a aquisição de dados é um microscópio fluorescente padrão. Uma vantagem adicional para este ensaio baseado em células é a capacidade de rastrear rapidamente o efeito de mutações de pontos relevantes da doença nas interações trans. Isso pode ser realizado transfecando células HEK com cDNAs das variantes mutantes da proteína de interesse.
Neste protocolo, apresentamos um exemplo no qual investigamos se uma mutação missense em Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificada em um paciente diagnosticado com profunda deficiência intelectual e epilepsia, altera interações em trans com proteína trans trans reito transmembrana 2 (LRRTM2). Neurexin3α é um membro da família evolutivamente conservada de moléculas de adesão celular pré-sináptica e, embora o trabalho recente tenha identificado múltiplos papéis na sinapse3,4,5,6,7, nossa compreensão sináptica desta molécula e todos os membros da família neurexina permanecem incompletos. LRRTM2 é uma proteína de adesão celular pós-sináptica excitatória que participa da formação e manutenção da sinapse8,9,10. É importante ressaltar que o LRRTM2 interage exclusivamente com isoformas de neurexina que não possuem o local da emenda 4 exon alternativo (SS4-), mas não com isoformes de neurexina contendo o local da emenda 4 exon alternativo (SS4+). A mutação missense humana (A687T) identificada em Neurexin3α está localizada em uma região extracelular não estudada que é evolutivamente conservada e é conservada entre todas as neurexinas alfa7. Como a interação entre essas duas moléculas foi estabelecida8,9,11, colocamos a questão: a capacidade de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2 é alterada por uma mutação de ponto A687T? Este ensaio revelou que a mutação de ponto A687T aumentou inesperadamente a agregação de Neurexin3α para LRRTM2 sugerindo que a região extracelular em que a mutação de ponto está localizada, desempenha um papel na mediação de interações transsinápticas.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubation of mixed population of HEK cells</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&amp;mdash;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterilization of HEK media</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td><td>Ward&amp;rsquo;s Science</td><td>470224-998</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>6 well sterile tissue culture plates</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>culturing HEK cells</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td></tr><tr><td>Centrifuge- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>75004377</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>CO2 cell incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubation of HEK cells during growth</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &amp;amp; sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passaging/harvesting HEK cell</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Harvesting HEK cells</td></tr><tr><td>Falcon Vented culture flasks, 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; growth area</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Culturing HEK cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK cell maintenance</td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>Model system</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Image analysis</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK cell resuspension</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Calcium phosphate transfection</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passaging HEK cells</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td></td><td></td><td>Incubation of mixed population of HEK cells</td></tr><tr><td>UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Image acquisition</td></tr><tr><td>Wide-field microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Image acquisition</td></tr></tbody></table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

As interações proteicas nas interfaces celulares ditam uma infinidade de desfechos biológicos que vão desde o desenvolvimento de tecidos e progressão do câncer até a formação e manutenção da sinapse. Muitas dessas interações fundamentais ocorrem em trans e são tipicamente induzidas por interações heterofílicas ou homofílicas entre células expressando pares de ligação ancorados na membrana. Elucidar como mutações relevantes para doenças interrompem essas interações proteicas fundamentais pode fornecer uma visão de uma miríade de campos de biologia celular. Muitos ensaios de interação proteína-proteína não normalmente desambiguam entre interações cis e trans, o que potencialmente leva a uma superestimação da extensão da ligação que está ocorrendo in vivo e envolve purificação intensiva de proteínas e/ou equipamentos de monitoramento especializados. Aqui, apresentamos um protocolo simples otimizado que permite a observação e quantificação de apenas interações trans sem a necessidade de purificações de proteínas longas ou equipamentos especializados. O ensaio de agregação celular HEK envolve a mistura de duas populações independentes de células HEK, cada uma expressando ligantes cognatos ligados à membrana. Após um curto período de incubação, as amostras são imagens e os agregados resultantes são quantificados.

A mutação A687T aumenta a ligação Neurexin3α SS4 ao LRRTM27 Para investigar como as interações intercelulares de duas proteínas sinápticas conhecidas são afetadas pela introdução de uma mutação pontual encontrada em um paciente com deficiência intelectual e epilepsia, utilizamos o ensaio de agregação celular HEK acima(Figura 1). As células foram transfeinadas de acordo com a seção 1 e preparadas para imagens de acordo com as seções 1 e 2 do protocolo. As células foram imagens na linha de base onde nenhuma agregação foi observada como esperado (não mostrada). As imagens adquiridas em 60 minutos foram analisadas como na seção 3 do protocolo. Para minimizar o viés de seleção, as condições foram aleatórias para cegar o experimentador. Por razões semelhantes, todo o campo de visão de cada imagem foi selecionado como um ROI.
As condições em que as células não expressavam ligantes sinápticos (GFP/mCherry) apresentaram agregação mínima após uma incubação de 60 minutos(Figura 2). Igualmente, condições em que apenas uma das duas populações de células expressava ligantes sinápticos (mCherry/LRRTM2-GFP ou GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) exibiam agregação mínima após uma incubação de 60 min(Figura 2). Como esperado, as condições que continham duas populações de células com moléculas de aderências incompatíveis (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) não apresentaram agregação em 60 minutos(Figura 2B). Essas condições serviram como controles negativos críticos, pois o LRRTM2 é conhecido por vincular-se exclusivamente ao SS4 carece de isoforms (SS4-) de Neurexins e destaca a especificidade deste ensaio de agregação.
Condições com moléculas de adesão compatíveis8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) apresentaram agregação significativa após uma incubação de 60 min(Figura 2C). A agregação pode ser visualizada como amarela e está presente na sobreposição entre as células(Figura 1 e Figura 2). Surpreendentemente, a condição em que Neurexin3α A687T SS4- foi co-incubada com LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) exibiu significativamente mais agregação em comparação com sua contraparte do tipo selvagem (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP). Isso sugere que a mutação de ponto A687T em Neurexin3α aumenta as capacidades de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61237/61237fig1.jpg"> Figura 1. Fluxo de trabalho de ensaio de agregação. ( A )Ascélulas HEK293T são transfeinadas usando uma proteína-1/mCherry, ou uma proteína-2/GFP. (B) Expressão de Neurexin3α leva 48 h. (C) As células são colhidas usando 10 mM EDTA e depois pelotas(D). (E) As células são misturadas em uma proporção de 1:1 e resuspended em 500 μL de mídia HEK contendo 10 mM CaCl2 e MgCl2. (F) As células são incubadas à temperatura ambiente até que ocorra a agregação e uma imagem final seja adquirida no 'tempo 60'. A agregação é visualizada como o número de puncta amarela visível no campo de visão. Nenhuma agregação é observada quando as células não estão expressando os pares de ligantes receptores corretos e são, portanto, vistas como puncta vermelha ou verde individual. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61237/61237fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61237/61237fig2.jpg"> Figura 2. Neurexin3αA687T SS4- tem agregação aprimorada com ligante excitatório LRRTM2 em comparação com Neurexin3αWT SS4-. (A) Imagens representativas de controles negativos após uma incubação de 60 min de mCherry com GFP, mCherry com LRRTM2, GFP com Neurexin3αWT SS4+/-, e GFP com Neurexin3αA687T SS4+/-. A agregação foi observada após 60 minutos em ambos LRRTM2 com Neurexin3αWT SS4-, e LRRTM2 com Neurexin3αA687T SS4-. (B) Quantificação do índice de agregação em todas as condições SS4+ após 60 minutos. Índice de agregação = área de sobreposição/(área do canal 1 + área do canal 2 – área de sobreposição) x 100. (C) Mesmo que(B) mas SS4-. Os dados apresentados representam a média ± SEM do número de experimentos (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Os números apresentados nos bares representam o número de experimentos independentes realizados. As linhas pontilhadas representam a linha de base ou agregação mínima média das condições de controle. A significância estatística foi determinada por ANOVA unidirecional, múltiplas comparações; *p<0.05; p<0.0001.Este valor foi modificado a partir de Restrepo et al.7. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61237/61237fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivos de codificação suplementar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61237/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esses arquivos.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.5K visualizações.  University of Colorado Denver School of Medicine. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Vídeo: Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Bioquímica

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Bioengenharia

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biologia

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Quantificação baseada em imagens de moléculas únicas de células vivas de interações proteicas

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Autor em destaque: Avaliação da dinâmica proteína-condensado em células humanas vivas

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

Abordagens genéticas e bioquímicas para

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares