A montagem eficiente de estruturas supramoleculares para o mínimo de design celular e entrega de medicamentos permanece desafiadora. Aqui, demonstramos protocolos eficientes que produzem estruturas supramoleculares baseadas em proteínas anfílicas semelhantes a elastina. Os protocolos de montagem apresentados geram estruturas supramoleculares versáteis com propriedades físico-químicas adaptáveis, como vesículas, fibras e coacervates.
Compartimentos à base de membrana proteica demonstram o comportamento de separação de fases e permitem o encapsulamento de moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas. Para a expressão de F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry, inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura da noite para um OD600 de 0,3. Incuba-o em 400 mililitros de meio LB estéril suplementado com antibióticos apropriados a 37 graus Celsius e 200 rpm.
Quando a cultura de expressão atingir OD600 de 0,5 a 0,8, adicione IPTG a uma concentração final de um mililitro, e reduza a temperatura de incubação para 20 graus Celsius. Para a expressão de ELP anfílico com o aminoácido não natural, inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura E.coli durante a noite contendo os plasmídeos apropriados a um OD de 0,3. Incuba-o em 400 mililitros de meio LB estéril suplementado com kanamicina e clororamfenicol a 37 graus Celsius e 200 rpm.
Para preparar o estoque de aminoácidos não naturais de 100 mililitros, adicione 206,2 miligramas de aminoácido não natural a oito mililitros de água ultrauso. Levante o pH da solução com hidróxido de sódio de três molares e misture vigorosamente. Quando o aminoácido não natural for dissolvido, baixe o pH para aproximadamente 10,5 e adicione água ultrapura a um volume de 10 mililitros.
Filtre a solução com um filtro estéril de 0,22 micrômetros e aliquot-la em tubos de reação de dois mililitros. Quando a cultura de expressão chegar a OD600 de 0,5 a 0,8, adicione o aminoácido não natural a uma concentração final de dois milimiliar. Incubar por mais 10 minutos.
Em seguida, induzir a expressão da proteína alvo e a síntese tRNA necessária através da adição simultânea de IPTG e arabinose. Reduza a temperatura de incubação para 20 graus Celsius, e permita que a expressão continue por aproximadamente 20 horas. Após a incubação, colde as células por centrifugação a quatro graus Celsius e 4.000 vezes g por 40 minutos.
Resuspense a pelota de célula no tampão de lise com lise e PMSF. Incubar a solução por 30 minutos no gelo. Em seguida, congele e descongele duas vezes submergindo em nitrogênio líquido.
Sonicar a suspensão, e limpar o lysate por centrifugação a 10.000 vezes g e quatro graus Celsius por 40 minutos. Em seguida, purificar a proteína usando cromatografia de afinidade. Após a elução da proteína, armazene-a a quatro graus Celsius até usar mais.
Adicione um microliter de corante fluorescente a 500 microliters de solução ELP, e incubar a reação por cerca de 10 horas a 15 graus Celsius enquanto treme em um ThermoMixer, certificando-se de protegê-lo da luz. Para remover o corante fluorescente excessivo, equilibre uma membrana de diálise em água ultrauso por 10 minutos. Corte a membrana no tamanho correto a ser colocado em cima da abertura do tubo de reação com a solução ELP clicada.
Em seguida, fixar a membrana na abertura fechando o tubo com uma tampa que não tem núcleo. Encha o espaço entre a tampa e a membrana com tampão para evitar a captura de ar. Em seguida, coloque o tubo de reação no tampão escolhido, empurre-o para baixo da superfície e vire-o de cabeça para baixo.
Realize a diálise por pelo menos três horas a quatro graus Celsius, permitindo que a diálise continue por pelo menos mais três horas após cada troca de buffer. Para o inchaço thf, dilante a solução ELP homogênea contra fosfato ou tampão tris com pH estável 7.5. Prepare o liofilizador e esfrie-o à temperatura inicial para a secagem congelante.
Aliquot a solução de proteína dialisada em tubos de reação de 1,5 mililitro, e selar com tampas com um pequeno orifício para evitar perder a amostra sólida devido a mudanças de pressão no curso da secagem congelante. Congelar as amostras em nitrogênio líquido. Retire as amostras de proteína congelada do nitrogênio líquido e coloque-as imediatamente no liofilizador para começar a secar.
Depois que a amostra estiver completamente seca, ventile-a com nitrogênio seco e feche imediatamente as tampas do tubo de reação para evitar contato com a umidade do ar. Adicione THF puro às amostras liofilizadas e coloque a solução em um sônico de banho de água com água gelada por 15 minutos. Pré-aqueça um termociclador a 30 a 60 graus Celsius para formação de vesículas ou até 90 graus Celsius para formação de fibras, e prepare novos tubos de reação com água ultrauso ou tampão.
Após a sônicação, coloque a solução ELP/THF e a água ou tampão preparado no termociclador por cinco minutos. Em seguida, estratifique a solução ELP em cima da água ou do buffer, certificando-se de que a separação das duas fases e uma interfase distinta seja visível e coloque a mistura de volta no termociclador. Deixe a amostra esfriar à temperatura ambiente por 10 minutos e prossiga com diálise contra água ou tampão ou com microscopia de fluorescência.
Prepare uma solução ELP de um a 50 micromolar e adicione de 10 a 20%1-butanol. Misture imediatamente a solução pipetting para cima e para baixo. A turbidez da solução deve aumentar durante a mistura, indicando a formação de vesículas.
Para obter uma distribuição de tamanho estreito, extrude vesículas com uma mini extrusora através de uma membrana com um tamanho de poro de um micrômetro. Para encapsulamento de corantes, misture aproximadamente 40 microliters de solução ELP em Tris-HCl de 10 mililitros com um microliter de solução de estoque Dextran Texas Red em DMSO. Adicione 10 microliters de 1-butanol, e extrude cinco a dez vezes através de uma seringa equipada com uma agulha de 0,25 por 25 milímetros.
O método de inchaço thf é composto de três etapas sucessivas e resulta em diferentes conjuntos supramoleculares do ELP dependendo da temperatura. As imagens de microscopia de epifluorescência mostram vesículas montadas a partir de BDP-R20F20 e estruturas fibrilares montadas a partir de BDP-R40F20. O método de extrusão de 1 butanol leva exclusivamente à formação de vesículas ELP.
Cerca de duas ordens de magnitude mais vesículas são produzidas em comparação com o método de inchaço THF. O BDP-R40F20 foi misturado com butanol de 10 a 15%, e as vesículas foram preparadas via extrusão da mistura. Diferentes estruturas supramoleculares foram montadas a partir de BDP-R40F20 através do protocolo de inchaço THF.
O pH do tampão e a temperatura do processo de montagem foram ajustados para formar coacervates, fibrilas ou vesículas. Pequenos erros no protocolo de montagem podem levar à formação de agregados. Corante carregado positivamente ATTO Rho 13 e o polissacarídeo dextran vermelho 3000 foram encapsulados no lúmen de vesículas montados a partir de F20R20-mEGFP através do método de extrusão de 1 butanol.
As imagens de microscopia confocal mostram as vesículas no canal verde, a carga no canal vermelho e o encapsulamento bem sucedido no canal fundido resultante. Também foi demonstrado o comportamento de separação de fases e fusão dos anfífilos ELP após a mistura de blocos de construção únicos do PMBC versus populações montadas do PMBC. A mistura prévia à montagem do PMBC leva a moléculas distribuídas de forma homogênea dentro da membrana PMBC montada, enquanto a mistura de populações de vesículas montadas leva a manchas de membrana de fluorescência vermelha ou verde que são visíveis por pelo menos 20 minutos.
Ao tentar este procedimento, é importante prestar atenção à ordem de passo correta e às diferenças entre o método de inchaço thf e o método de extrusão butanol. Seguindo este protocolo, as vesículas ELP podem ser usadas como transportes de entrega de drogas, como plataforma para reações enzimáticas, como transcrição in vitro e tradução, ou na formação de células mínimas sintéticas.
