A transdução de sinais é um dos tópicos mais importantes da pesquisa biológica e farmacêutica. Requer proteínas de membrana para transmitir sinais à proteína do parceiro de sinalização intracelular. Este protocolo foi projetado para realizar uma triagem sistemática de detergente na preparação de um complexo de sinalização visando a determinação da estrutura.
Este protocolo utiliza técnicas comumente disponíveis em um laboratório de biologia bem estabelecido e ser facilmente realizado pelos iniciantes no campo. Compreendemos esses métodos para encontrar o parâmetro mais crítico na preparação do complexo proteico da membrana. Para começar, descongele 30 gramas de hek293 GNT I-deficiente de pelotas celulares para temperatura ambiente e transfira-a para um béquer.
Adicione 120 mililitros de tampão PBS contendo coquetel inibidor de protease e homogêneo usando um homogeneizador Dounce ou um homogeneizador elétrico a 13.000 RPM por 30 segundos. Ajuste o volume para 150 mililitros com tampão PBS. Adicione suavemente 10% DDM às células homogeneizadas para dar uma concentração final de 1,25% Mexa no gelo por uma hora.
Após a solubilização, centrifugar a célula lísato a quatro graus Celsius e 150,000 vezes G por 45 minutos para remover os detritos nãosolubilizados. Transfira o supernascente para uma garrafa de 500 mililitros e adicione 10 mililitros da resina de imuno-afinidade 50%1D4. Misture suavemente o liseto celular solubilizado e a resina por quatro horas ou durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a ligação proteica.
Carregue a mistura de resina de lise em uma coluna aberta para coletar a resina. Lave a resina com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem A para remover o contaminante proteico. Feche a válvula e resuspenja a resina com dois volumes de coluna de buffer A.Em seguida, sob condição de luz vermelha fraca, adicione 9-cis Retinal à resina resuspended a uma concentração final de 50 micromolar.
Misture suavemente a quatro graus Celsius por quatro a 16 horas no escuro para a ligação retinal. Depois disso, abra o valor e remova o buffer da coluna. Lave a resina com 20 volumes de coluna de buffer A, seguida por 15 volumes de colunas de tampão B para remover retinal desvinculada.
Resuspenda a resina em dois volumes de coluna de buffer B e, em seguida, divida a suspensão da resina igualmente para 10 colunas de descarte de 10 mililitros. Remova o buffer das 10 colunas e, em seguida, ressuspenque a resina em um mililitro de tampão C para troca de detergente. Incubar por uma hora no gelo.
Repita a lavagem e a incubação no buffer C mais uma vez. Remova o buffer das colunas e, em seguida, ressuspenda a resina em 0,8 mililitros de tampão de elução para cada coluna. Misture delicadamente por duas horas.
Colete a elução de cada coluna em um tubo. Resuspenda a resina em 0,7 mililitros de tampão de elução para cada coluna. Misture delicadamente por uma hora.
Colete a elução de cada coluna nos mesmos tubos. No escuro, carregue a proteína iludida para o cuvette de quartzo. Meça o espectro da amostra de proteínas.
Ilumine a proteína diretamente no cuvette por dois minutos com passagem de luz através de 495 nanômetros de filtro de passagem longa. Meça o espectro da amostra iluminada. Realize a mesma medição para todas as amostras de proteínas purificadas nos outros nove detergentes.
Estados escuros e iluminados. Sob luz normal, para cada condição de detergente prepare 100 microliters de rodopsina a 0,7 miligramas por mililitro. Sob luz vermelha fraca, prepare 100 microliters de mistura de rodopsina a 0,7 miligramas por mililitro e mini-GO a 0,2 miligramas por mililitro.
Supleça a mistura com um cloreto de magnésio milimila. Ilumine a mistura com luz de um filtro de passagem longa de 495 nanômetros e incubar por 30 minutos. Transfira as amostras para os frascos de amostrador automático e coloque-as na bandeja de amostras.
Programe um arquivo de método para automatizar as execuções SEC sequenciais para cada amostra com o carregador automático carregando 77 microliters da amostra para a coluna e o purificador iludindo 25 mililitros de buffer SEC por execução. Regisso absorvente em 280 nanômetros e 380 nanômetros. Colete as frações de pico de rhodopsin e rhodopsin-mini-GO no volume de retenção em torno de 12,9 mililitros.
Analise as amostras de rodopsina esquerda e as frações máximas do complexo rhodopsin-mini-GO em géis de gradiente de denaturing de 4 a 12%SDS com coloração azul Coomassie. Prepare uma mistura de 200 microliter de rhodopsin a um miligrama por mililitro e PNGase F a 0,01 miligramas por mililitro. Misture bem e incubar no gelo durante a noite.
Prepare uma mistura de 200 microliter de rhodopsin a um miligrama por mililitro e Endo F1-13 a 0,01 miligramas por mililitro. Misture bem e incubar no gelo durante a noite. Analise o resultado da digestão por SDS-Page e Coloração azul Coomassie.
Neste estudo, a configuração de purificação em pequena escala produziu proteína suficiente para análises posteriores. Espectros visíveis ultravioletas de rhodopsina mostram o estado escuro 9 cis Retinal amarrado rhodopsin em curvas azuis. Após a iluminação, 9 cis Retinal é desproteinado e isomeriza em toda trans-Retinal.
As proporções de absorventes a 280 nanômetros sobre absorventes 488 nanômetros e absorventes a 280 nanômetros sobre absorventes a 380 nanômetros retratam a estabilidade da rodopsina purificada em cada detergente. Perfis de cromatografia de exclusão de tamanho de rhodopsin e complexo rhodopsin-mini-GO purificados em 10 detergentes diferentes são mostrados aqui. O perfil das proteínas marcadores padrão é mostrado como sobreposição juntamente com a amostra de DDM.
A interpretação dos perfis de pico é mostrada para DMNG com o cenário ideal visto para DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 e OGNG. O perfil ampliado da amostra OGNG mostra que tanto o complexo de rodopsina quanto o complexo rhodopsin-mini-GO iludiram em torno do mesmo volume de retenção. A análise SDS-Page de rhodopsin e SEC amostras purificadas do complexo rhodopsin-mini-GO é mostrada aqui.
Este número mostra a análise SDS-Page da deglycosylation de rhodopsin com enzimas Endo F1 e PNGase F. É fundamental realizar a triagem de detergente de forma sistemática, para que o impacto de cada detergente individual possa ser claramente comparado sem ambiguidade. Para proteínas de várias quantidades, o ensaio de mudança térmica também pode ser usado para estudar o impacto do detergente na estabilidade proteica.
Graças a este método, somos capazes de preparar complexos proteicos estáveis e eventualmente resolver a estrutura cristalina perdida na geomontagem. Forneceu insights importantes sobre a especificidade de interação proteica GPCR-G.
