Este método permite analisar a barreira hemencefálica humana medindo a travessia bacteriana em diferentes tratamentos. Pode ajudar a descobrir a patogênese da meningite bacteriana e o delírio pós-operatório. É um método simples e os efeitos do tratamento são diretamente representados pelo número de bactérias.
Pode ser modificado para permitir a análise de alto rendimento de compostos nas células endoteliais. Comece montando a placa de 12 poços em um armário de segurança biológica. Desempacotar a placa e cada inserção, em seguida, use fórceps esterilizados para pegar as pastilhas em sua base e colocá-las nos poços.
Cubra a membrana porosa de cada inserção com 90 microlitadores de 10 microgramas por mistura de colágeno microliter IV e fibronectina e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, lave as pastilhas duas vezes, encanar um mililitro de PBS em cada inserção e aspirando-o com uma bomba de vácuo. Em seguida, equilibre as membranas ao tubo de tubos pré-armados DMEM F12 médio nas câmaras superior e inferior e incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para semear as células endoteliais microvasculares humanas, aspirar o meio do frasco de cultura celular e lavar as células com 10 mililitros de PBS. Cubra as células completamente com cinco mililitros de trippsina EDTA e incubar o frasco por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Transfira cinco mililitros das células em um tubo de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de FCS contendo meio para parar a reação enzimática.
Centrifugar a suspensão por três minutos a 210 vezes g, remover o supernaspe e resuspensar a pelota da célula em cinco mililitros de médio. Adicione 10 microliters da suspensão celular a 10 microliters de 0,4% de mancha azul trypan, em seguida, adicione 10 microliters da mistura a uma câmara de contagem. Coloque a câmara de contagem no balcão da célula e inicie o programa apropriado certificando-se de que o contador está focado.
Após a contagem, semente 200.000 células em cada câmara superior na placa de 12 poços e incubar a placa a 37 graus Celsius por 14 dias mudando a mídia na câmara superior e inferior a cada dois ou três dias. Após 14 dias, certifique-se de que a confluência celular é 100% ao imagens deles com um microscópio. Um dia antes da medição da permeabilidade, colocou uma colônia de cepa E.coli GM2163 em três mililitros de meio LB.
Cultue as células a 37 graus Celsius por 24 horas em um shaker de incubação. Para tratar as células com um composto de interesse, dilui-as à sua concentração final no meio DMEM F12 e adicione essa mistura nas câmaras superior e inferior na placa de 12 poços, em seguida, incubar a placa em uma incubadora de cultura celular. Após a incubação, troque o meio completo com meio livre de antibióticos.
Determine a concentração da cultura bacteriana durante a noite medindo sua densidade óptica em 600 nanômetros, em seguida, dilui-lo para um OD600 de 0,5 em um tubo Falcon de 50 mililitros. Em um gabinete de segurança biológica, adicione 450 microliters da solução bacteriana em cada câmara superior da placa de 12 poços, em seguida, incubar a placa por seis horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a inserção com fórceps e prove 50 microlitadores do meio de cada câmara inferior, tomando cuidado para não derramar o meio das câmaras superiores para as mais baixas.
É importante separar estritamente a mídia da câmara superior e inferior como uma repercussão das bactérias da câmara superior levaria a resultados falsos positivos. Solte cada amostra em uma placa de ágar separada e esque a solução com um espalhador de células. Incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas, depois conte as colônias.
Para investigar o efeito da glicação na travessia microbiana através da barreira hematoencefálica, as células foram tratadas com uma solução glixacional de 0,5 milimiliar por uma hora com células não tratadas servindo como controle. A glicoção foi então detectada através de imunoblotting com anticorpos anti-IDADE. As colônias bacterianas obtidas foram contadas e representadas como o número absoluto de colônias ou o número relativo de colônias normalizadas ao controle.
Amostras tratadas com glixal apresentaram um número aumentado de colônias indicando que o tratamento tem um efeito na densidade da barreira celular. Para investigar a glicização da proteína induzida pela glicose, os THBMECs foram cultivados em glicose normal e meio de glicose alta. O número absoluto de colônias e o número relativo de colônias normalizadas ao controle indicaram que a glicose não teve efeito significativo na integridade da barreira hemencefálica.
As células endoteliais tratadas podem ser analisadas por abordagens proteômicas, por exemplo, espectrometria de massa, para analisar alterações no proteome. Essa técnica ajuda na compreensão da barreira heórfencena humana e da travessia bacteriana. Pode ser usado para descobrir aspectos do envelhecimento e doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer.
