O objetivo geral deste procedimento é delinear as etapas cirúrgicas envolvidas na implantação de matrizes de microeletrodos para registro eletrofisiológico crônico em saguis de comportamento livre. Saguis são pequenos primatas que estão sendo cada vez mais usados em pesquisas de neurociência. Esses animais compartilham muitas das vantagens práticas e logísticas dos roedores.
Sua propensão para a twinning e alta fecundidade em idades jovens significa acesso pronto a coortes grandes e geneticamente semelhantes. Além disso, seu pequeno tamanho corporal os torna fáceis e relativamente baratos de se cuidar. Como primatas, o sagui tem um sistema nervoso central que é muito mais semelhante a um humano do que o de um roedor.
Isso inclui um córtex pré-frontal altamente desenvolvido e sistema visual. Uma vantagem que os saguis têm sobre muitas outras espécies de primatas, no entanto, é o progresso feito em modificá-los geneticamente. Com um genoma profundamente sequenciado e sucesso gerando animais fundadores, é claro que o sagui está pronto para se tornar um modelo poderoso para estudar a função cerebral em saúde e doença.
Um método comum para a função cerebral de estudo envolve a implantação de eletrodos em locais anatomicamente específicos. Isso permite que se regise cronicamente a atividade neural em diferentes áreas alvo em animais acordados e livremente comportados. Antes da cirurgia, determine a coordenada intraoral zero para todos os implantes e guias.
Para isso, conecte cada matriz de eletrodos que será implantado em um suporte de eletrodo e coloque um micro fio no zero intraoral. É aqui que as barras de ouvido se encontram. Repita isso para as matrizes e suportes adicionais de eletrodos, se necessário.
Além disso, repita isso com uma agulha de calibre 24 igualmente ligada a um suporte de sonda estereotaxic. Para matrizes eletrofisiológicas, um fio moído deve ser soldado para todos os outros parafusos que serão usados. Por fim, organize e esterilize todos os instrumentos, equipamentos e descartáveis na preparação para o procedimento cirúrgico.
No dia da cirurgia, assegurem que o animal não come há seis horas antes do início da anestesia. Atropina e cetamina serão usadas para induzir anestesia por injeções intramusculares sequenciais. Em seguida, raspe a cabeça dos animais usando cortadores de barbeiro.
É importante entubar o animal durante a cirurgia. Nosso método preferido envolve anexar uma faixa elástica à mesa cirúrgica que inserimos atrás dos caninos animais enquanto está em uma posição supina. Em seguida, usamos uma sonda de ponta de algodão para limpar a língua do sagui e agarrá-la em uma mão.
Isso permite que um técnico abra a boca e as vias aéreas com apenas uma mão. Depois de inserir o tubo endotraqueal, conecte-o ao conjunto de anestesia com o ventilador artificial definido para 40 respirações por minuto. Fixar o tubo e o conjunto com fita adesiva, conforme necessário.
Com o sagui agora em posição propensa fixe a cabeça do animal no quadro estereotaxista. Para isso, primeiro, insira a ponta da barra de ouvido direita no canal auditivo direito do animal. Seguido pela barra de ouvido esquerda no canal auditivo esquerdo.
Em seguida, a cabeça deve ser nivelada de forma que o plano horizontal esteja paralelo com o quadro, enquanto o plano anterior/posterior está centrado. Isso é conseguido primeiro centralizando a cabeça do animal usando as medidas da barra de ouvido presas a distâncias iguais. Depois disso, a parte da boca é inserida na boca do animal, e ajustada até tocar a paleta do animal, enquanto as barras orbitais estão apenas tocando a margem inferior do osso orbital.
Como o plano horizontal é definido como o plano passando pela margem inferior do osso orbital e o centro do medius auditivo externo, deve-se certificar-se de que a superfície inferior do osso orbital está agora horizontalmente alinhada com o centro das barras de ouvido antes de prosseguir. Durante o procedimento, é importante manter todos os sinais vitais. Assim, deve-se conectar um oxímetro de pulso portátil à mão do sagui para garantir que a frequência cardíaca e a saturação de oxigênio estejam dentro das faixas aceitáveis.
Além disso, uma sonda de temperatura retal conectada a uma almofada de aquecimento homeotérmico fixada para 37 graus centígrados e colada na cauda, garantirá que a temperatura corporal do sagui não seja afetada negativamente pela anestesia. O passo final pré-operatório é limpar e desinfetar a cabeça raspada do animal com clorexidina e iodo, antes de cobrir o animal com um campo cirúrgico esterilizado. Realize uma incisão na linha média do couro cabeludo depois de aplicar um analgésico local neste local.
Para preparar a superfície do crânio, primeiro, desprende cuidadosamente o músculo temporal do crânio. Isso é feito cortando a fossa em sua inserção no crânio com um bisturi. Depois disso, o músculo temporal deve ser suavemente separado do crânio, utilizando um raspatório periosteal.
Continuando com o raspatório periosteal remova o periosteum de todo o crânio exposto raspando. Em seguida, marque a localização da craniotomia criando buracos rasos na superfície óssea e perfurando o perímetro da craniotomia. Faça de seis a oito orifícios de parafuso, conforme necessário, no crânio e implante os parafusos.
Neste momento, enrole os fios de terra soldados a um determinado parafuso ao redor do parafuso adjacente não queimado. Remova o osso no centro da craniotomia usando fórceps McPherson. Enquanto o cérebro e dura mater são descobertos mantê-los hidratados com soro fisiológico estéril.
Para remover a dura-máter, uma agulha de calibre 25 ou 26 deve ser dobrada a aproximadamente 90 graus para facilitar a pontuação e levantar a superfície da dura-se mater para longe da superfície do cérebro. Neste ponto, micro tesouras são usadas para extir esse consumo da dura-maternidade. Conecte os eletrodos ao micromanipulador estereotaxico e posicione-o, de modo que o eletrodo esteja nas coordenadas anterior/posteriores desejadas e medial/lateral.
Agora, abaixe a ponta do eletrodo até tocar a superfície do cérebro. Insira lentamente a matriz no cérebro, até atingir as coordenadas dorsais/ventral desejadas. Adicione uma gota de tinta prateada entre o fio moído e cada parafuso para garantir uma conexão elétrica.
Fixar o eletrodo no crânio aplicando acrílico dentário no crânio exposto, um parafuso e a matriz de eletrodos. Repita este procedimento de implantação com quaisquer matrizes adicionais. Finalmente, usando acrílico dental, faça uma tampa de cabeça resistente ao redor da extensão lateral das matrizes e completamente no caso dos fios de terra e de qualquer crânio ou parafusos expostos.
Se necessário, pode-se inserir uma barra de apoio na tampa da cabeça e selá-la no lugar com acrílico dental. Após a criação da tampa da cabeça suturar a pele se o músculo ou tecido ósseo for exposto. Uma solução antisséptica também deve ser aplicada à ferida neste momento.
Com a cirurgia concluída é hora de começar a recuperação. Primeiro, desligue o suprimento isoflurane, mas não o oxigênio, e remova o animal do quadro estereotaxico. Coloque o animal na página de aquecimento, com o oxigênio mantido através do tubo endotraqueal.
Quando o primeiro sinal de reflexos neurogênicos, como espasmos laríngeos, remova o tubo endotraqueal. O oxigênio deve agora ser fornecido com uma máscara até que o animal apresente sinais claros de recuperação anestésico, como reflexos protetores, tom postural e tentativas de ambulação. O sagui deve ser alojado individualmente, e deixado para se recuperar em uma gaiola limpa e espaço por 24 a 48 horas, antes de retornar à sua gaiola.
Animais implantados devem ser alojados em gaiolas separadas. É importante observar o animal por pelo menos uma hora após a cirurgia para observar sinais de angústia e, especificamente, movimentos descoordenados. Antibióticos e analgésicos e anti-inflamatórios devem ser administrados nos dias seguintes à cirurgia para controlar a dor e prevenir a infecção.
Em cirurgias bem sucedidas, o animal deve ser completamente recuperado dentro de três a cinco dias. Recomendamos que as sessões de gravação eletrofisiológica comecem pelo menos uma semana após a cirurgia. No início de cada sessão de gravação anestesia levemente o animal usando isoflurane e conecte o conector de matrizes de eletrodos a um sistema de gravação neural.
Coloque o animal dentro da câmara experimental e aguarde a recuperação completa do anestésico antes de iniciar as gravações. Após uma cirurgia bem sucedida, é possível registrar picos e potenciais de campo locais dos eletrodos implantados ao longo de várias semanas. Em última análise, uma confirmação final de que as matrizes de eletrodos foram implantadas com sucesso nas estruturas alvo deve ser pré-formada após a morte.
Seções manchadas de nissl contendo trilhos eletro podem ser usadas para determinar a posição de cada micro fio implantado. Gravações eletrofisiológicas crônicas em animais de comportamento acordado são técnicas poderosas usadas em muitas linhas de pesquisa em neurociência. Como o sagui comum oferece muitas vantagens sobre modelos historicamente populares, o objetivo deste vídeo, é ajudar outros neurocientistas a adotar o sagui comum para sua pesquisa.
Além da implantação de eletrodos de gravação crônica, conforme detalhado neste vídeo, o mesmo protocolo de cirurgia estereotaxic pode ser adaptado para muitas outras extremidades experimentais, incluindo implantação de eletrodos estimulantes, cânulas guia e microinjeções. Ao adaptar este protocolo para uma das técnicas mencionadas, o cirurgião modificará principalmente o procedimento de perfuração para se adequar ao tamanho do implante desejado. Além disso, o procedimento de solo não é necessário para muitas dessas técnicas e pode, portanto, ser omitido.
Independentemente do objetivo experimental, depois de assistir a este vídeo você deve ter um entendimento sobre como realizar com sucesso neurocirurgia estereotaxica no sagui comum.
