Nossos dados demonstram que a inibição transitória da atividade rho-quinase aumenta a adesão, sobrevivência e engrafamento de cardiomiócitos derivados do hiPSC após serem transplantados nos corações animais infartados. Fornecemos um método simples, de baixo custo, enquanto altamente eficiente para aumentar o enxerto de cardiomiócitos transplantados derivados de hiPSC nos corações animais feridos. Como essa técnica pode melhorar as taxas de enxercimento celular de forma segura e eficiente em infarto cardíaco agudo e insuficiência cardíaca, contribui para as melhorias resultantes na função cardíaca, vasculares e apoptose.
Embora só tenhamos testado nossos protocolos em hiPSCs, esses métodos podem ser aplicados a outros tipos de células, como células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais, etc. A dose e duração do tratamento Y-27632 é crítica. A demonstração visual pode demonstrar em grande detalhe todos os passos-chave do protocolo, o que é benéfico para alguém que nunca realizou essa técnica antes.
No dia 21, após a diferenciação hiPSC-CM, aspire o meio e lave as células com PBS estéril uma vez. Incubar as células com 0,5 mililitros de enzimas de dissociação celular por poço a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos. Após o tempo de incubação, pipeta repetidamente a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro, a fim de dissociar completamente as células.
Em seguida, adicione um mililitro de solução neutralizante a cada poço, colete a mistura celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g por três minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque as células na solução neutralizante. Em seguida, replante as células em placas revestidas de gelatina, seis poços a uma densidade de dois milhões de células por poço.
Após 24 a 48 horas, substitua o meio de cultura pelo meio de purificação por três a cinco dias. Antes do transplante, cultura as células do grupo de tratamento por 12 horas em RB-plus médio suplementado com 10-micromolar Y-27632. Da mesma forma, realize o tratamento verapamil nas células do meio RB-plus com um micromole de verapamil por 12 horas.
Após o tratamento, lave os hiPSC-CMs com PBS uma vez, e incuba as células com 0,5 microliters de enzimas de dissociação celular por poço por um máximo de dois minutos. Pipeta repetidamente a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro para dissociar completamente as células. Em seguida, neutralizar as células com solução neutralizante, coletar a mistura celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífugas a 200 vezes g por três minutos.
Após a centrifugação, resuspengue as células em PBS a uma concentração de 0,1 milhão de células por cinco microliters em preparação para a injeção. Imediatamente após a indução do infarto do miocárdio, injete cinco microliters de controle hiPSC-CMs, Y-27632-pré-tratado hiPSC-CMs, hiPSC-CMs tratados com verapamil, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local, um na área de infarto e dois nas áreas ao redor do infarto. 12 horas antes de realizar a detecção transitória e contralute de cálcio, adicione 10 micromolar Y-27632, 100-nanomolar RA, verapamil de um micromolar, ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs.
Em seguida, descarte o meio e lave a placa com PBS uma vez. Altere o DMEM médio para um DMEM sem fenol contendo 0,02 peso por volume por cento do políil surfactante, indicador de cálcio de cinco micromolares e o Y-27632 correspondente, RA, verapamil, ou um volume igual de PBS, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, descarte o supernasce, lave as células com o DMEM sem corante três vezes e deixe o meio descansar por 30 minutos para desesmagizar o corante de mapeamento.
Coloque o deslizamento de cobertura semeado por células em uma câmara de banho aberta e insira a câmara em um sistema de microincubstura equilibrado a 37 graus Celsius com um controlador de temperatura automático. Perfumá-lo com a solução de Tyrode e adicione continuamente RI, RA ou PBS à solução de perfusão. Use um microscópio de fluorescência invertida e uma cabeça de varredura a laser para registrar um transitório de cálcio espontâneo, empregando uma varredura de linha X-T.
Regissocular a contração espontânea de hiPSC-CMs utilizando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal. A taxa de sobrevivência das células transplantadas foi confirmada pelo aumento da atividade da luciferase. O aumento da troponina cardíaca t e a expressão do antígeno nuclear humano mostraram que o pré-tratamento Y-27632 poderia melhorar significativamente a taxa de enxercimento celular.
As células pré-tratadas Y-27632 apresentaram uma estrutura citoesquelélada maior e mais definida em forma de vara. Além disso, o pré-tratamento Y-27632 diminuiu as células tunel-positivas, indicando a redução da apoptose hiPSC-CM transplantada in vivo. A mancha ocidental sugeriu que o pré-tratamento Y-27632 aumentou a expressão de beta-1 e N-cadherin integrin e diminuiu a expressão da cadeia de luz fosfo-miosina 2.
Essa mudança foi normalizada 72 horas após a retirada do Y-27632. Experimentos in vitro de fixação de células HL-1 indicaram que o pré-tratamento Y-27632 aumentou significativamente a adesão do hiPSC-CM em relação ao HL-1. O pré-tratamento Y-27632 reduziu a força contratil, o pico da fluorescência transitória do cálcio e a duração transitória do cálcio.
Y-27632 pré-tratamento regulado contração de cardiomiócitos reduzindo significativamente a expressão de 2008 e cTnT. Semelhante ao Y-27632, o pré-tratamento verapamil aumentou a atividade da luciferase e o número de células hcTnT/HNA duplamente positivas. O passo mais importante é cultivar as células do grupo de tratamento por 12 horas em rb-plus médio suplementado com 10-micromolar Y-27632.
Com base neste método, a liberação lenta do Y-27632 para aumentar ainda mais a taxa de enxerximento celular é uma estratégia promissora. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem a fisiologia e a função do hiPSC dos CMs in vivo. A pequena molécula CHIR99021 usada para diferenciação de cardiomiócitos é perigosa, o que pode causar irritação respiratória.
Por favor, não ingestão ou inalar de forma alguma.
