Este protocolo demonstra um novo método para edição de genoma multiplex de saccharomyces cerevisiae introduzindo múltiplas fitas de expressão em diferentes loci em um único passo de transformação. Esta abordagem de montagem plasmida livre de clonagem para expressar uma única matriz de crRNA, leva a um protocolo de edição de genoma rápido, eficiente e flexível. Vamos projetar células de levedura tipo selvagem, para produzir carotenoides introduzindo genes heterologos gratuitos em loci genômico livre.
A matriz de crRNA única é composta de crRNAs individuais gratuitas expressas pelo promotor livre de polimerase RNA. Cas12a processa in vivo a matriz crRNA em crRNAs individuais. O guia crRNAs Cas12a para o loci alvo no DNA genômico onde Cas12a introduz quebras duplas de fios.
Fragmentos de DNA descendentes recombinam para recombinação in vivo e integram-se ao DNA genômico. Demonstrando o protocolo será Klaudia Ciurkot, uma estudante de doutorado. Jeffery van Wijk, um cientista associado.
E Brenda Vonk, uma cientista associada sênior do nosso laboratório. Depois de obter uma única matriz de crRNA para experimentos de edição de genoma multiplex de DNA sintético, prepare a mistura de amplificação pcr e carregue a matriz no termociclador para amplificação. Para analisar os produtos PCR por eletroforese, execute as amostras em um gel de 0,8% agarose a 5 V/cm por 40 minutos.
Carregue a escada de DNA com os fragmentos de DNA que variam de 100 10000 pares de base Em seguida, purifique os produtos PCR usando um kit de purificação PCR de acordo com as instruções do fabricante. Para a transformação da levedura, comece por levedura silvestre pré-cultura em um frasco de 100 mL contendo 20 mL de extrato de levedura peptone dextrose ou meio YEPD. Para uma incubação noturna, a 30 graus Celsius, e 250 rotações por minuto Na manhã seguinte, inocularei 20 mL de meio leveço fresco com um volume calculado de levedura pré-cultura durante a noite.
Coloque a cultura em uma incubadora de agitação até que uma densidade óptica de 1.0, medida em 600 nanômetros seja alcançada. Colher as células de levedura por centrifugação. Lave a pelota da célula de levedura em 20 mL de água desmineralizada à temperatura ambiente, seguida de uma centrifugação adicional.
Resuspenja a pelota em 100 microlitadores da solução tris-EDTA de acetato de lítio e transfira a levedura para um tubo de microcentrifuuge. Misture cinco microliters de DNA portador mono-encalhado e um micrograma de pCSN067 plasmídeo com a suspensão da célula de levedura. Em seguida, misture 600 microliters de solução liac-TE de polietileno glicol com a amostra.
Incubar as células de levedura e plasmídeo por 30 minutos a 30 graus Celsius e 450 prm em um bloco de calor superior da mesa. Ao final da incubação, misture 70 mL de sulfóxido de dimetila com a solução de transformação. Aqueça a mistura por 15 minutos em um banho de água de 42 graus Celsius.
Transfira a mistura para um tubo de fundo redondo de 15 mL. Adicione 10 mL de YEPD ao tubo para uma incubação durante a noite a 30 graus Celsius e 250 rpm. Na manhã seguinte, colete as células transformadas por centrifugação, e aspire todos, menos os 200 microliters finais do supernante.
Resuspend a pelota de célula de levedura transformada no restante supernante. Placa 150 microliters da mistura de transformação, e 150 microliters de uma diluição de 20 vezes dos 50 microliters restantes de mistura de transformação em YEPD, em placas de ágar YEPD, complementados com 0,2 gramas por litro de G418. Depois de 48 a 72 horas a 30 graus Celsius, escolha um único transformador para re-streaking em uma nova placa de ágar YEPD complementada com 0,2 g/L de G418.
Para a segunda transformação, cresça a cultura para uma densidade óptica a 600 nanômetros de 1.0, como apenas demonstrado. E adicione 20 microliters de células a um tubo de microcentrífuga. Após a centrifugação, resuspenque a pelota celular em 100 microliters da solução LiAc-TE e adicione ssDNA.
Em um tubo separado, combine um micrograma da matriz de crRNA única, um micrograma do plasmídeo receptor linearizado para a matriz de crRNA, um micrograma de cada DNA doador e um micrograma de cada região de flanqueamento. Em seguida, transfira a mistura de DNA para o tubo de células competentes de levedura e complete a segunda transformação como demonstrado para a primeira transformação. Na manhã seguinte, colete as células por centrifugação e resuspenque a pelota em uma pequena alíquota de supernasce.
Em seguida, a placa 150 microliters da mistura de transformação, e 150 microliters de uma diluição de 20 vezes da mistura de transformação em meio YEPD, em placas de ágar YEPD complementadas com 0,2 g/L G418, e 0,2 g/L nourseothricin Após 48 a 72 horas, a 30 graus Celsius, escolha um único transformador colorido para re-streaking em uma nova placa YEPD para obter colônias coloridas únicas. Para determinar a eficiência de edição do genoma, conte o número de colônias coloridas e brancas nas placas de transformação, e divida o número de colônias coloridas pelo número total de colônias. Para criar a arte pixel de levedura, inocular flasks de shake individual de 500 mL contendo 100 mL de meio YEPD com três carotenoides de cores diferentes produzindo cepas de S.cerevisiae, e um tipo selvagem CEN.
Tensão PK113-7D. Incubar as culturas durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 250 rpm. Transfira 0,5 mL de cada cultura durante a noite para tubos individuais contendo 0,5 mL de gradiente de densidade não iônica estéril por tubo, e misture brevemente as soluções por vórtice.
Transfira as suspensões celulares para um reservatório individual e qualificado 2 por 3 poços. Use um arquivo csv com a configuração de calibração de fluido 6RES_AQ_GPSA2 em um instrumento de manipulador de líquido acústico para detectar 25 nanoliters de cada cepa S.cerevisiae da placa de origem do reservatório qualificada apropriada para uma microplacão de destino 6144 contendo 50 mL de ágar YEPD. Quando todos os poços foram vistos, incubar a microplacão a 30 degress Celsius por 48 horas.
Para intensificar as cores das cepas, armazene as placas de ágar a 4 graus Celsius por pelo menos 72 horas. Uma foto de Rosalind Franklin apareceu no prato. Como demonstrado, promotor, quadro de leitura aberto, exterminador e duas sequências contíguas de conector de 50 bps podem ser montados em um de expressão através de uma reação de clonagem golden gate, e verificado por PCR.
Após a amplificação da matriz de crRNA única por PCR, o plasmídeo receptor para a matriz de crRNA único é linearizado conforme confirmado pela eletroforese. A eficiência da Edição do Genoma Multiplex pode ser calculada pela porcentagem de colônias coloridas após a transformação, e pelos resultados das análises pcr que confirmam a integração do DNA do doador nos locais de DNA genômico pretendidos. Por exemplo, a partir de uma imagem em preto e branco de Rosalind Franklin, foi criada uma lista de quatro cores de imagem e manchas que foi então usada para detectar as quatro cepas diferentes de leveduras em uma microplaca de ágar através de um manipulador líquido acústico, como demonstrado, resultando em uma pintura de levedura de alta resolução do cientista.
Para essa transformação, use soluções recém-preparadas e fragmentos de DNA de alta qualidade. Este método também pode ser aplicado para introdução multiplex de exclusões definidas e mutações pontuais no DNA genômico. Além disso, experimentos de regulação crispr podem ser realizados.
Este método pode ser modificado para introduzir mais do que crRNAs gratuitos dentro de uma matriz para aumentar o número de modificações simultâneas que podem ser feitas.
