A convecção aprimorada da entrega, ou CED, de vetores virais optogenéticos em primatas não humanos permitirá que os pesquisadores manipulem a atividade neural em larga escala para entender computaçãos e comportamentos neurais complexos. Com CED podemos alcançar alta expressão optogenética em grandes regiões do cérebro primata com apenas algumas injeções em um curto espaço de tempo em comparação com os métodos tradicionais. A ressonância magnética ou implantação de câmara compatível com Mr é realizada utilizando-se a prática padrão em cirurgias de primatas não humanos, o procedimento é descrito detalhadamente no protocolo de texto e delineado brevemente neste vídeo.
Após sedação animal, posicionamento e incisão inicial, conforme descrito no protocolo de texto, crie uma craniotomia circular para cobrir as trajetórias pré-planejadas para injeções usando uma trefina. Crie um recuo no centro da craniotomia planejada suficientemente profunda no crânio para ancorar a trefina usando o ponto de centro ajustável da trefina. Uma vez feito o centro, abaixe a trefina sobre o crânio e gire a trefina no sentido horário e anti-horário, aplicando pressão para baixo até que a tampa óssea possa ser removida com fórceps.
Depois de levantar a dura como detalhado no protocolo de texto, corte a dura do centro até a borda da craniotomia e continue ao longo da borda com uma tesoura oftálmica fina. Monte a convecção cilíndrica feita sob medida de entrega de câmara compatível com MR ao crânio em cima da craniotomia para fornecer suporte à cânula durante a infusão de tal forma que a curvatura da flange da câmara se alinha bem com a curvatura do crânio. Fixar os implantes no crânio usando parafusos plásticos e acrílicos dentários ou alguns parafusos de titânio.
Logo após implantar a câmara compatível com Mr e inserir a grade de injeção de cânula na câmara, encha a grade com soro fisiológico de 0,9% para visualizar os locais de injeção através de imagens anatômicas mr. Preencha também as cavidades da câmara com espuma de gel absorvível estéril úmida para manter a umidade do cérebro. Cubra a pele e o cilindro com uma cortina de incisão antimicrobiana estéril para manter a esterilidade dos cilindros durante o transporte e as infusões de MR.
Coloque uma cápsula de vitamina E para marcar o topo da rede de injeção para identificação positiva. Enquanto o animal permanece entubado, retire o tubo endotraqueal do circuito de anestesia e recoloque-o em uma máquina de isoflurane compatível com MR portátil. Transporte o animal para o scanner de ressonância magnética.
Adquira imagens T1 para calcular a distância do topo da grade de injeção e da superfície cortical. A cápsula de vitamina E é claramente visível em imagens T1 e deve ser usada como um marcador para o topo da grade de injeção. Adquira imagens T2 para determinar os guias de cânula ideal para cada local com base no local alvo da infusão.
A grade da cânula é preenchida com soro fisiológico que é melhor visível em imagens T2. Usando o software de imagem MR, percorria os planos coronal e sagital para encontrar o local alvo da infusão. Depois de descongelar o vetor viral por algumas horas à temperatura ambiente, misture o vetor viral com o agente de contraste MR gadoteridol por pipeta ou mistura de vórtice.
Carregue o vírus misto em tubos iv de alta pressão de 0,2 mililitro. Utilizando tubos IV de alta pressão, conecte uma longa linha de extensão a uma seringa de três mililitros compatível com MR e prime com soro fisiológico. Conecte a outra extremidade da tubulação de extensão longa ao tubo iv de 0,2 mililitro carregado com o vírus.
Em seguida, conecte a cânula resistente ao refluxo com uma ponta pisada de um mililitro na extremidade distal deste conjunto com um conector de cateter estilo grampo. Por fim, coloque a seringa em uma bomba compatível com MR. Utilizando as imagens mr anatômicas da linha de base obtidas, selecione o local da grade de injeção de cânula e a profundidade de inserção necessária para chegar ao local de infusão de destino.
Marque a profundidade de inserção na cânula usando fita estéril. Inicie a infusão a uma taxa de um microliter por minuto e valide visualmente o fluxo do fluido na linha de infusão observando a ejeção de fluido da ponta da cânula. Insira a cânula manualmente através da grade de injeção até a profundidade do alvo, mantendo o fluxo na linha de infusão, pois isso impedirá que o tecido penetrado entupida a cânula durante a inserção.
Agora, adquira imagens rápidas de flash T1 para monitoramento on-line da infusão de vetor viral. Depois de infundir aproximadamente 10 microliters do vetor de tal forma que o vírus suficiente é infundido para detectar no scanner mr, obtenha imagens de MR para verificar a colocação correta da cânula, conforme evidente pela propagação observada do vírus. Se a profundidade da cânula inserida estiver incorreta, ajuste a profundidade de acordo ou lentamente remova a cânula e ressarca a inserção.
Monitore a infusão através de orientação de imagens de MR on-line. Aumente a taxa de infusão para cinco microliters por minuto por um microliter por minuto a cada poucos minutos. É importante aumentar a taxa de infusão lentamente e não exceder cinco microliters por minuto, pois altas taxas de infusão podem causar danos teciduais.
Depois de infundir aproximadamente 40 microliters do vetor viral, comece a reduzir a taxa de infusão em um microliter por minuto. Pare a infusão depois que aproximadamente 50 microliters são injetados. Deixe a cânula no lugar por dez minutos.
Remova lentamente a cânula do cérebro e vá para o próximo local. Cubra o cilindro com uma cortina estéril no final das injeções antes do transporte animal e, em seguida, transporte o animal de volta para a sala de cirurgia. Análises histológicas em seções coronárias seriais revelam expressão optogenética em larga escala ao redor dos locais de infusão.
Aqui está a imagem de MR coronal da linha de base e a disseminação do agente de contraste após a infusão para a mesma fatia coronal mr. Uma seção de tecido coronal é mostrada aproximadamente a mesma. A coloração de peroxidase reflete a expressão da proteína fluorescente amarela ou repórter da EYFP.
Observa-se bom alinhamento entre a área de expressão EYFP, medida com epifluorescência superficial e com coloração histológica. Estes incluem a região de difusão vetorial estimada a partir de imagens mr. Pontos brancos indicam locais de injeção e toda a região negra representa a área exposta pela craniotomia.
Aqui mostrada está uma imagem de baixa ampliação das seções coronais manchadas com anticorpo anti GFP mostrando o aspecto lateral medial da expressão YFP no córtex somatosensorial. A ponta da flecha preta indica a localização da faixa da cânula. O tecido adjacente é mostrado em maior ampliação para mostrar distribuição laminar das células positivas YFP.
Regiões densamente povoadas de células positivas YFP estão localizadas predominantemente em camadas de dois a três e cinco a seis. O alargamento adicional revela células piramipúneis típicas nas camadas dois a três, camada cinco e camada seis. É importante deixar a cânula no lugar por 10 minutos após o fluxo parar.
Isso garantirá que o vírus tenha percolado no tecido neural alvo circundante. CED é uma abordagem eficiente para alcançar níveis de expressão uniformemente altos em grandes regiões cerebrais em mamíferos. Tem o potencial de expandir nossa compreensão de circuitos neurais e conectividade.
Após a transdução viral por CED, experimentos subsequentes de estimulação optogenética podem ser emparelhados com gravação elétrica e ensaios comportamentais para revelar a dinâmica complexa do circuito dentro do cérebro. Esta técnica foi anteriormente empregada por Yazdan-Shahmorad e colegas em 2018, na qual a modulação neural optogenética foi usada para induzir mudanças de conectividade amplas na rede no córtex motor sensorial.
