O objetivo de ensaios de leveduras um híbrido aprimorados é identificar o conjunto de fatores de transcrição que se ligam a uma sequência de DNA de interesse. A vantagem desta técnica é que ensaios de leveduras um híbrido aprimorados podem avaliar mais de 1000 fatores de transcrição em um único experimento. Por outro lado, a imunoprecipitação de cromatina avalia apenas um fator de transcrição por vez.
Este método constitui uma ferramenta-chave para a genômica funcional para identificar o repertório de fatores de transcrição que se ligam a promotores e intensificadores genéticos e identificar fator de transcrição alterado vinculando-se a variantes não codificadoras. Demonstrando o procedimento será o Dr. Xing Liu um pós-doutor do meu laboratório. Descongele as placas de estoque de glicerol de levedura com a matriz de presas TF no gelo.
Resuspenha a levedura usando uma pipeta de 12 canais e prossiga para o próximo passo dentro de 1 a 3 minutos. Para detectar o fermento em placas retangulares de sc menos triptofano, use um robô de matriz de alta densidade para selecionar placas multiwell 96 como a fonte, 96 placas de ágar como o alvo e 96 almofadas de pinos longos. As almofadas de pinos não são reutilizáveis e devem ser descartadas.
Selecione o programa Spot Many para fazer duas cópias por placa de 96 poços. Não use as opções de reciclagem ou revisitar para evitar a contaminação dos estoques congelados. Além disso, selecione a opção de girar para cima e para baixo na fonte para misturar o fermento.
Siga as instruções de onde e quando colocar as placas e deixe que o robô localmente a levedura em Sc menos placas retangulares do triptofano. Ensace a matriz manchada e incuba-a lateral de ágar até 30 graus Celsius por 2 a 3 dias. Para gerar 384 matrizes de colônia em Sc menos placas retangulares do triptofano, selecione 96 placas de ágar como fonte, 384 placas de ágar como alvo e 96 almofadas de pinos curtos.
Em seguida, selecione o programa de 1:4 array single source. Desta forma, quatro 96 placas de colônia serão consolidadas em uma placa de 384 colônias. Não use as opções de reciclagem ou revisitar para evitar contaminação entre diferentes placas.
Ensace as placas e incuba o conjunto de ágar 384 colônias a 30 graus Celsius por 2 dias. Para gerar 1536 matrizes de colônias em Sc menos placas retangulares do triptofano, selecione 384 placas de ágar como fonte, as placas de ágar 1536 como alvo e 384 almofadas de pinos curtos. Em seguida, selecione o programa de 1:4 ensaio único de origem.
O objetivo é copiar cada colônia em quatro colônias para obter quadruplicatos. Use as opções de reciclagem e revisitar, pois isso envolve copiar cada colônia 4 vezes. Siga as instruções do robô e permita que o robô localmente o fermento nas placas antes de ensacar e incubar o lado ágar da matriz de 1536 colônias a 30 graus Celsius por 3 dias.
Para amplificar a matriz de 1536 colônias em Sc menos placas retangulares triptofano, selecione 1536 placas de ágar como fonte, 1536 placas de ágar como alvo e 1536 almofadas de pinos curtos. Selecione o programa Replicar Muitos para replicar de 3 a 4 cópias. Use a opção reciclar e revisitar, mas jogue fora a almofada ao mudar para uma placa diferente da matriz para evitar contaminação cruzada.
Permita que o robô amplie a matriz de 1536 colônias em Sc menos placas retangulares do triptofano. Finalmente, ensace as placas e incuba o agar da matriz de 1536 avistados até 30 graus Celsius durante 3 dias para usar em etapas de acasalamento. Para preparar os gramados da isca de DNA para acasalamento, localmente as iscas de levedura de DNA em uma placa sc menos uracil e histidina e crescer por 3 dias a 30 graus Celsius.
Coloque a levedura em uma placa sc de 15 centímetros menos uracil e histidina usando um palito estéril para que cada placa se encaixe de 12 a 16 cepas diferentes. Incubar a placa um dia a 30 graus Celsius. No dia seguinte, coloque a levedura em uma placa sc de 15 centímetros menos uracil e histidina usando um palito estéril para que cada placa se encaixe em 4 cepas diferentes.
Incubar a placa por um dia a 30 graus Celsius. Após a incubação, raspe a levedura usando um palito estéril, certificando-se de não raspar nenhum ágar. Adicione o fermento em um tubo de 1,5 mililitro com 500 microliters de água estéril.
Agora adicione 10 a 15 contas de vidro estéreis e a suspensão da levedura em uma placa retangular YAPD. Agite bem em todas as direções por um minuto para garantir que o fermento esteja espalhado por toda a placa. Inverta a placa imediatamente, e bata para que as contas vão para a tampa.
Remova e recicle as contas. Ensace as placas e incuba-as lado do ágar para baixo por 1 a 2 dias a 30 graus Celsius. Então, vá para a etapa de acasalamento.
Para acasalar a isca de DNA de levedura e as cepas de matriz TF, transfira a matriz TF para uma placa retangular YAPD com o robô. Selecione a placa de ágar 1536 como a fonte e o alvo, e a almofada de pino curto de 1536. Selecione o programa Replicar Muitos.
Selecione 4 placas de origem e as opções de reciclagem e revisite. Cada placa de matriz TF pode ser usada para transferir de 3 a 4 placas YAPD. As placas de matriz TF usadas para acasalar devem ter de 2 a 3 dias, mas não mais, pois o acasalamento pode ser ineficiente.
Para transferir o gramado de uma isca de DNA para as placas yapd já contendo o array TF, selecione a placa de ágar 1536 como a fonte e o alvo e a almofada de pino curto 1536. Selecione o programa Replicar Muitos. Use um deslocamento aleatório na fonte com um raio de aproximadamente 0,6 milímetros para evitar tomar levedura do mesmo local e selecione Mix no Alvo para facilitar o contato entre as cepas de leveduras.
Use o gramado contendo as iscas de DNA como fonte, e as placas yapd contendo a matriz TF manchada como o alvo antes de ensacar as placas e incubar-as lado ágar até 30 graus Celsius por um dia. Para seleção de levedura diploide, selecione a placa de 1536 ágar como a fonte e o alvo e selecione a almofada de pino curto 1536. Selecione o programa Replicar.
Selecione Mix na Fonte e no Alvo. Permita que o robô transfira o fermento acasalado das placas yapd para as placas sc menos uracil e triptofano antes de ensacar as placas e incubar-as do lado ágar até 30 graus Celsius por 2 a 3 dias. Agora, selecione as placas de 1536 ágar como a fonte e o alvo e a almofada de pino curto 1536.
Selecione o programa Replicar. Transfira a levedura diploide das placas Sc menos uracil e triptofano para a leitura retangular 3-AT e X-gal contendo placas usando o robô. Ensace as placas e incuba-as lateral até 30 graus Celsius por até 7 dias.
Para iscas de DNA com atividade de repórter de fundo alto, tire fotos nos dias 2, 3 e 4. Caso contrário, tire fotos nos dias 4 e 7. Mantenha as placas de matriz TF em temperatura ambiente e copie novamente após 7 dias para uma nova rodada de triagem.
Para ilustrar o tipo de resultados que podem ser obtidos usando ensaios de leveduras uni-híbridos aprimorados, as regiões promotoras dos genes CCL15 e IL17F foram rastreadas contra uma matriz de 1086 TFs humanos. O promotor CCL15 é um exemplo de uma isca de DNA não autoativa, onde as interações, mesmo as fracas, podem ser facilmente detectadas. O promotor do IL17F é um exemplo de uma isca de DNA autoativa com atividade de repórter de fundo desigual onde algumas interações podem ser detectadas, enquanto para vários TFs, é incerto se a atividade do repórter é maior do que o fundo.
Existem vários problemas que podem ocorrer ao realizar ensaios de leveduras um-híbrido aprimorados. Neste caso, as colônias são muito pequenas e não conseguiram se transferir. Normalmente, aproximadamente 95% das colônias de presas TF apresentam crescimento normal.
Neste exemplo, não há crescimento de levedura em uma porção da placa. Esta questão está geralmente relacionada a uma falha na etapa de acasalamento se a almofada de pino 1536 não fizer contato com o fermento no gramado da isca de DNA, na matriz TF, ou na placa de acasalamento. Nestes dois exemplos, não são detectadas interações.
Esta questão está frequentemente relacionada a mutações inativas não intencionais nos genes repórteres, em particular LacZ, ou autoatividade muito alta que mascaram interações. Neste caso, a placa apresenta manchas azuis aleatórias que muitas vezes estão relacionadas à contaminação bacteriana. A coisa mais importante a considerar é a preparação adequada da placa.
Certificando-se de que todos os componentes são adicionados e que a altura do ágar é uniforme, pois todas as etapas subsequentes dependem disso. Embora a maioria dos reagentes não sejam perigosos, é importante usar luvas o tempo todo para evitar a contaminação das amostras e placas. Como em qualquer ensaio de ligação de DNA, é importante validar as interações identificadas usando ensaios funcionais como ensaios de repórteres, knockdown de fator de transcrição ou nocaute, seguido pela expressão de medição do gene alvo.
Este método permitiu a identificação de fatores de transcrição que regulam genes envolvidos em processos biológicos particulares, bem como fatores de transcrição com vinculação alternativa a variantes não codificadas associadas a doenças.
