Esta técnica nos permite medir a suscetibilidade de antibióticos em condições mais clinicamente relevantes. A técnica também nos permite determinar a verdadeira concentração de antibióticos que podem matar bactérias em agregados. Esta técnica pode ser aplicada para determinar a concentração necessária para eliminar agregados de GC.
O método também pode ser aplicado à medição da suscetibilidade antimicrobiana de qualquer bactéria capaz de formar agregados. Preste atenção às etapas de lise para garantir que a lise esteja completa. Caso contrário, o ensaio de medição ATP subestimará o número de bactérias viáveis.
A visualização desse método permitirá que outros pesquisadores sigam e repliquem este experimento com consistência. Comece por estilhaços de Neisseria gonorrhoeae, ou cepas GC, em ágar GCK suplementado com 1%Kellogg para uma incubação de 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, use um microscópio leve para selecionar cuidadosamente colônias pili-negativas sem bordas escuras ou colônias pili-positivas com bordas escuras de cada placa, e coloque as colônias escolhidas em novas placas GCK para uma cultura de 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Na manhã seguinte, use um aplicador estéril para coletar colônias de GC de cada placa e resuspensar cada cotonete em caldo quente complementado com 4,2% de bicarbonato de sódio e 1% solução Kellogg. Meça a densidade óptica em 650 nanômetros, ou OD650, para determinar a concentração das bactérias suspensas e ajuste a concentração de GC para cerca de uma vez 10 para as oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, adicione 99 microliters da suspensão gc em poços individuais de uma placa de 96 poços e permita que as bactérias se agreguem a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas.
No final da incubação, adicione um microliter de ceftriaxona diluída em série a cada poço deixando alguns poços não tratados para servir como controles e devolver a placa à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, sonicar a suspensão em cada poço três vezes a 144 watts e 20 kilohertz por cinco segundos por sônica e adicionar 100 microliters de reagente de brilho de utilização ATP comercialmente disponível a cada poço. Transfira cuidadosamente 150 microliters de mistura de cada poço em poços individuais de uma nova microplaca preta de 96 poços e meça a absorção de cada poço a 560 nanômetros em um leitor de placas.
Em seguida, calcule a taxa de sobrevivência pela razão da leitura obtida após o tratamento de antibióticos em série para a leitura dos poços não tratados. Para visualização dos agregados gc vivos/mortos, use um aplicador estéril para coletar GC das placas cultivadas durante a noite e resuspensar o GC em meio GCP pré-armado complementado com 1%Kellogg. Meça o OD650 por espectrofotometria e ajuste a concentração para aproximadamente uma vez 10 para as sete unidades formadoras de colônias por mililitro.
Em seguida, adicione 198 microliters de suspensão GC em câmaras de oito poços e incuba as câmaras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Ao final da incubação, trate as bactérias com dois microlitadores de ceftriaxona por condição de agregação e devolva as câmaras à incubadora para o período de incubação experimental adequado. Ao final da incubação, adicione 0,6 microliters de solução de coloração viva/morta em cada poço e devolva as câmaras à incubadora por mais 20 minutos.
Em seguida, use um microscópio confocal para obter imagens da série Z. Para medir o tamanho dos agregados gc, abra a primeira imagem no ImageJ e selecione linhas à mão livre para circular a área de cada agregação na imagem. Clique em analisar e medir.
O tamanho dos agregados será indicado sob a coluna da área. Para quantificar a razão de intensidade de fluorescência da coloração viva para a morta em cada agregado, clique em analisar e definir medições e verifique a densidade integrada na janela popup. Clique em OK e clique na ferramenta imagem, cor e canais.
Selecione a cor e o canal um como a fluorescência para coloração de bactérias mortas. Selecione linhas à mão livre para circular a área de cada agregação e clique em analisar e medir para obter a razão de intensidade de fluorescência para cada agregado na coluna de densidade integrada. Selecione o canal dois para a fluorescência para a coloração bacteriana viva e meça a intensidade da fluorescência em cada agregado como apenas demonstrado.
Em seguida, divida os dados de intensidade de fluorescência viva pelos dados de intensidade de fluorescência morta para obter a razão de intensidade de fluorescência viva para morta. Neste experimento representativo, pili não agregado positivo, acumulado pili positivo ou agregado e interrompido pili positivo bactérias foram tratados com diluições seriais de ceftriaxona antes da medição de seus níveis DE ATP. GC pré-agregado demonstrou uma sobrevida significativamente maior do que o GC não agregado ou de agregação interrompido gc quando tratado com concentrações iguais de ceftriaxona ou superior.
Cepas pili-positivas que formam agregados maiores apresentaram os mais altos níveis de ATP após o tratamento ceftriaxona em comparação com as cepas mutantes. Independentemente da cepa testada, a coloração viva/morta antes do tratamento com antibióticos revelou bactérias mortas em grande parte localizadas nas camadas externas da cultura, enquanto a GC viva foi identificada principalmente dentro do núcleo de agregados tratados com ceftriaxona. Como esperado, as bactérias pili-positivas formaram os maiores agregados, enquanto as culturas pili-negativas formaram-se as menores.
Notavelmente, os agregados pili-positivos ainda estavam vivos em suas camadas principais após o tratamento com antibióticos, enquanto gc nos pequenos agregados mutantes soltos estavam mortos. Com base no tamanho e sobrevivência do GC, um gráfico de correlação pode ser traçado para examinar a relação entre o tamanho da agregação e a sobrevivência de antibióticos das bactérias. A sonicação é importante para garantir que a ATP de cada bactéria individual seja liberada dentro dos agregados firmemente vinculados.
Caso contrário, as medidas não serão consistentes. É importante emplacar as bactérias após o agresso e são tratadas com antibióticos para medir tanto as bactérias viáveis quanto as capazes de replicação. A técnica mede a influência da agregação de bactérias na suscetibilidade a antibióticos, permitindo que os pesquisadores desenvolvam melhores medicamentos para o tratamento de doenças.
