Este protocolo ajuda na investigação do papel das células imunes em determinados órgãos em saúde e patologia. A principal vantagem dessa técnica é que esta é uma técnica econômica, já que é uma técnica manual. Demonstrando o procedimento será Zhengkang Luo, um estudante de doutorado do meu laboratório.
Para começar, coloque as glândulas tímicas e baços de camundongos previamente eutanizados em frascos de cintilação de 20 ml, ou tubos cônicos de 15 ml, preenchidos com 5 ml da solução de sal balanceada de Hank. Coloque os linfonodos de drenagem pancreática em micro-tubos de 1,5 ml preenchidos com 1 ml de RPMI-1640. Certifique-se de usar todo o timo e baço, e todas as PDLNs.
Mantenha os órgãos no gelo durante todo o procedimento. Usando uma tesoura, esprema bem o timo e o baço para liberar as células imunes. Descarte as cápsulas timmáticas e esplênicas restantes.
Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 433 vezes g e a 4 graus celsius por cinco minutos, e descartar o supernante. Para lise os glóbulos vermelhos, suspenda a suspensão celular em 5 ml de cloreto de amônio molar de 0,2 molar e incubar à temperatura ambiente por dez minutos.
Inverta os tubos suavemente a cada dois minutos. No final da incubação, adicione 5 ml de HBSS para parar a lise. Centrifugar os tubos a 433 vezes g e a 4 graus celsius por cinco minutos.
Descarte o supernasce e suspenda as células em aproximadamente 5 ml de HBSS. Em seguida, encha os tubos com HBSS. Repita este processo, desde centrifugar as amostras até encher o tubo com HBSS, uma vez.
Centrifugar os tubos mais uma vez a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota no HBSS. Obtenha tubos de fundo redondo de 5 ml com tampas de coador de células.
Transfira 1 ml da suspensão da célula timiço e 500 microlitres da suspensão da célula esplênica para os tubos, aplicando a suspensão às tampas do coador celular. Primeiro, coloque um tubo cônico de 15 ml em um rack. Coloque uma malha metálica estéril de 250 micrômetros sobre o tubo.
Enxágüe a malha com 1 ml de RPMI. Em seguida, transfira os linfonodos para a malha metálica e use um par de pinças para moê-los através da malha. Aplique 1 ml de RPMI na malha para lavar as células no tubo.
Repita este processo de transferência e moagem dos linfonodos três vezes para cada amostra e, em seguida, remova a malha. Centrifugar os tubos a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em aproximadamente 5 ml de RPMI.
Em seguida, encha os tubos com RPMI. Repita este processo, desde centrifugar as amostras até encher o tubo com RPMI, uma vez. Centrifugar os tubos novamente a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos.
Descarte o supernatante e suspenda a pelota de célula em 2 ml de RPMI. Transfira 2 ml da suspensão celular para tubos de fundo redondo de 5 ml com tampas de coador de células. Primeiro, centrifugar a suspensão celular das amostras de timo, baço e PDLN a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos.
Descarte o supernaspeso. Manche as células com anticorpos superficiais conforme descrito no protocolo de texto e incubar os tubos no gelo por 40 minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão FACS a cada tubo.
Centrifugar a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos, e descartar o supernaspe. Repita este processo, adicionando o buffer, centrifugando e descartando o supernatante, uma vez. Suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão de fixação de permeabilização para corrigir e permeabiliar as células.
Transfira os tubos para uma geladeira a 4 graus celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugar os tubos a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernasciente e suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão de lavagem de permeabilização.
Centrifugar as células novamente a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos e descartar o supernasce. Colora as células com anticorpos intracelulares, conforme descrito no protocolo de texto. Incubar os tubos no gelo por 1 hora.
Depois disso, adicione 500 microliters de permeabilização de tampão de lavagem a cada tubo. Centrifugar a 433 vezes g e a 4 graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernasciente e suspenda a pelota em 500 microliters de tampão de lavagem de permeabilização.
Centrifugar mais uma vez a 433 vezes g e a quatro graus celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota da célula em 300 microliters de tampão FACS. Em seguida, analise as células em um citômetro de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto.
Neste estudo, as células únicas são isoladas de glândulas tímicas, PDLNs e baços de camundongos NOD glicícêmicos normais, e são manchadas com marcadores celulares Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios e neuropilina-1 para análise citométrica de fluxo. Os resultados são analisados e aqui são mostrados como estratégias representativas de gating. A proporção de células Helios-positivas entre as células Treg CD4-positivas, CD8-negativas, CD25-positivas, Foxp3-positivas é vista como maior do que a das células Nrp1-positivas nos três órgãos.
Mais de 80% das células Treg no timo são vistas para expressar Hélio, que é maior do que no PDLN, e o baço. A proporção de células NrP1 positivas entre as células Treg helios-positivas é vista como maior no PDLN do que aquelas no timo ou baço. A maioria das células Treg nrp1-positivas também expressa Hélio, e a proporção de células helios-positivas entre as células Treg nrp1 positivas é vista como mais alta no timo e baço do que no PDLN.
Juntos, esses resultados indicam que Helios é um marcador melhor para detectar células Treg do que nrp1. Linfonodos são pequenos, mas alguns marcadores intracelulares requerem um grande número de células para dar um bom sinal na citometria de fluxo. Outros métodos não podem ser realizados após este procedimento porque as células já estão manchadas e mortas.
Mas os quatro marcadores celulares do animal podem ser substituídos para estudar outros tipos de células imunes.
