Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia adiposa, como como as interações intercelulares e a fisiologia do tecido adiposo mudam em diferentes condições metabólicas, como jejum e obesidade. A principal vantagem desta técnica é que ela preserva de forma ideal a estrutura 3D adiposa original e evita longas etapas de processamento que geralmente são necessárias para a imunohistoquímica convencional. Embora este método possa fornecer uma visão da estrutura do tecido adiposo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos, como o sistema nervoso, por meio de toda a coloração do cérebro.
Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido às dificuldades em obter locais de tecido imobiliário, encontrar o período de fixação adequado e as concentrações ideais de anticorpos. Após a dissecação completa, transfira o prato contendo as amostras de tecido em 1%paraformaldeído do gelo para a temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, transfira os tecidos para uma placa de cultura celular de 12 ou 24 poços para uma lavagem mais rápida.
É importante lembrar que o procedimento de coloração de todo o montagem deve começar imediatamente após a dissecação e que não há pontos de pausa entre cada etapa. Lave os tecidos com PBS-0,3T em um agitador inclinado a 22 graus com uma velocidade entre 20 e 25 inclinações por minuto à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes adicionais.
Depois disso, adicione aproximadamente 0,5 a um mililitro de tampão de bloqueio contendo 5% de soro animal. Incubar a placa em um shaker usando as condições anteriores durante uma hora. Aspire a solução de bloqueio e adicione o mililitro de anticorpos primários diluídos em PBS-0.3T com soro animal de 1% para cada poço.
Incubar a placa durante a noite em um agitador a quatro graus Celsius com uma inclinação de 22 graus e uma velocidade de 20 a 25 inclinações por minuto. No dia seguinte, use PBS-0.3T para lavar os tecidos à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes adicionais.
Em seguida, adicione entre 0,5 e um mililitro de soluções de anticorpos secundários apropriadas e diluídas a cada poço. Enrole a placa em papel alumínio e incuba-a em um shaker à temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, lave a placa duas vezes com PBS-0,3T em temperatura ambiente por cinco minutos por lavagem.
Se for necessária a visualização de gotículas líquidas durante a mancha lipídica neutra, lave duas vezes com 1x PBS a cada lavagem com duração de cinco minutos. Adicione a mancha lipídica neutra diluída na PBS e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Para começar a imagem, use fórceps para colocar o tecido plano em um deslizamento de tampa de vidro de 24 por 60 milímetros.
Se for desejada a coloração dos núcleos com DAPI, adicione uma a duas gotas de um meio de montagem que contenha DAPI para submergir completamente o tecido e evitar que ele seque. Em seguida, coloque o slide em um sistema de microscópio a laser confocal invertido. Para obter imagens de tecido manchado de montagem inteira em vários planos focais, realize pilhas Z de 100 a 150 micrômetros de profundidade com tamanho de passo de quatro a seis micrômetros na ampliação desejada.
Neste estudo, a coloração de montagem inteira é usada para preservar a arquitetura de tecido adiposo. Ao contrário de métodos que envolvem múltiplas etapas de processamento e secção, que podem levar à desfiguração da morfologia tecidual adiposa, o método de coloração de todo o montagem pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo precisão na interpretação dos resultados. A superfixação do tecido adiposo leva à fluorescência induzida por fixação, que pode ser indicada por regiões idênticas sobrepostas, como nos sinais de hidroxilase de tirasina e PECAM-1 vistos aqui.
Amostras de manchas de montagem total devidamente fixas, no entanto, mostram sinais separados e distintos, indicando que esses sinais não são autofluorescência. A imagem de tecido adiposo manchado de montagem total permite a quantificação de alterações morfológicas em diferentes condições experimentais. Em particular, o tecido adiposo é altamente vascularizado, o que é importante na mediação da homeostase metabólica sobre rápidas mudanças no nível de energia.
Por exemplo, os camundongos C57 pretos 6J, que passam por 24 horas de jejum, apresentam um tamanho de adipócito significativamente menor, o que indica lipólise, e uma tendência na densidade elevada dos vasos sanguíneos quando comparados com camundongos continuamente alimentados. Limpar tecidos adiposos com iDISCO+permite que os tecidos adiposos se tornem opticamente transparentes. A imunolabelação do tecido adiposo que passou pela limpeza tecidual mostra arborização neural muito mais densa em comparação com a observada em coloração de montagem inteira sem limpeza tecidual na mesma ampliação.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não sobrefixar suas amostras por mais de uma hora em temperatura ambiente em PFA, caso contrário, isso aumentará a autofluorescência de fundo. No entanto, esse período de fixação pode ser prolongado se as amostras forem fixadas a quatro graus Celsius. Após esse procedimento, outros métodos como quantificação utilizando ImageJ, podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como como a arquitetura celular, como sítios adipócitos e densidade dos vasos sanguíneos, mudança em resposta a várias condições fisiológicas.
