Este método pode ajudar a responder à questão de como a integração do provírus do HIV influencia a expressão genética andrógina, e por que certos locais de integração genômica estão sendo selecionados em células ultimamente infectadas pelo HIV. A principal vantagem dessa técnica é que podem ser produzidos modelos in vitro para infecção pelo HIV, que carregam repórteres pró-virais direcionados aos locais de integração escolhidos usando a engenharia de genoma baseada em CRISPR/Cas9. Demonstrando o procedimento estarão Thomas Walther, um estudante de doutorado, e Julia Bialek, uma pós-doutora do meu laboratório.
Comece usando o Navegador de Genoma UCSC para extrair in-silico-extraindo a sequência genômica do lócus genômico desejado para ser alvo. Para escolher o guia RNAs de 20 nucleotídeos para direcionamento do lócus genômico escolhido, use a ferramenta web E-CRISP. Em seguida, selecione, Homo Sapiens Genoma Humano do Consórcio de Referência do Genoma:Construa 38.
Genoma de referência como o organismo e entrada 2.000 pares de base da sequência genômica, cobrindo o lócus genômico desejado anteriormente extraído. Inicie uma pesquisa guia-RNA usando configurações médias de aplicativos com qualquer PAM, qualquer base cinco-prime, off-targets toleram incompatibilidades e excluídos introns e ilhas CPG. Da lista com possíveis designs de guia-RNA que aparece, selecione um RNA guia com uma pontuação alta para especificidade e eficiência, que está perto o mais possível do lócus genômico desejado a ser alvo.
Abra o navegador NCBI Blast para explodir a sequência guia-RNA escolhida contra o genoma de referência. Para verificar a exclusividade do site de ligação guia-RNA selecionado, primeiro selecione humano como o genoma e, em seguida, insira a sequência guia-RNA como a sequência de consulta. Em seguida, selecione sequências altamente semelhantes ou Mega Blast como o programa para garantir que a sequência guia-RNA seja única.
Depois disso, selecione in-silico 1.000 pares de base, upstream e downstream de sequência guia-RNA a partir de sequência genômica extraída no início. Use estes 1.000 pares de base selecionados, rio acima e rio abaixo como braços de ecologia de cinco e três primos para direcionar a construção de vetores e a sequência de repórteres adjacentes a serem alvo. 24 horas antes da transfecção de células T jurkat, prepare uma placa completa de 6 poços das células para um único experimento de alvo.
Para começar, placa 1, 250.000 células em 2,5 mililitros de RPMI 1640 com suplementos e sem antibióticos, por poço. No dia seguinte, adicione aos microgramas de vetor circular de alvo e dois microgramas de Cas9 e expressão guia-RNA plasmid por poço, a 250 microliters de meio RPMI comercial otimizado para transfecção, em um tubo de reação e misture bem por vórtice. Em seguida, adicione lentamente 12 microliters de agente de transfecção ao meio de DNA sem tocar na parede do tubo.
Flick o tubo e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicione a mistura dropwise a um poço de células. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
E 72 horas após a transfecção, puxe as células transfeccionadas, conte-as e prepare-se para o enriquecimento pela FACS. Depois de confirmar os eventos de segmentação na população de células-alvo mistas, comece a gerar clones de células únicas preparando o meio em condição de jurkat com antecedência, coletando RPMI com antibióticos de células T jurkat saudáveis e não tratadas. Centrifugar os tubos por 5 minutos a 300 G, e filtrar o supernascer com uma seringa de 25 mililitros, usando um filtro de 0,22 micrômetros em novos tubos cônicos de 50 milímetros.
Conte as células-alvo previamente enriquecidas pelo FACS, 10 a 14 dias após a expansão, e depois dilui-as em RPMI com antibióticos para uma concentração de 100.000 células por mililitro. Diluir 100 microliters desta diluição celular com 9,9 mililitros de média para atingir 1.000 células por mililitro. Em seguida, diluir um mililitro desta diluição com nove mililitros de média a uma concentração de 100 células por mililitro.
Para a placa 96 placas de poço para conter uma célula por poço, misture suavemente um mililitro de solução de 100 células por mililitro com cinco mililitros de condição média e quatro mililitros de meio fresco, em um reservatório de reagente estéril. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 microliters da respectiva diluição celular por poço de novas placas de fundo redondas de 96 poços para alcançar uma e duas células por diluições de poço. Empilhe as 96 placas do poço e cubra cada pilha com uma placa de seis poços contendo três mililitros de PBS por poço.
Incubar as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono, por três semanas. Após a incubação completa, confirme visualmente a presença de colônias cultivadas usando microscopia leve com ampliação quatro vezes, e marque os poços com colônias cultivadas. Células suavemente resuspendas de uma marcada bem por pipetação.
Transfira 100 microliters desta suspensão celular para um poço de placa de fundo redonda recém-preparada com 100 microliters de RPMI com antibióticos, por poço e repita para todos os poços marcados, misture suavemente por pipetação. Para duplicar a placa, transfira 100 microliters desta suspensão celular para uma segunda placa vazia de fundo redondo de 96 poços e repita este processo para todos os poços marcados. Finalmente, preencha os poços em branco com 200 microliters de RPMI com antibióticos.
Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois que a placa duplicada tiver incubado por 24 a 48 horas, duplique-a novamente adicionando 100 microliters de RPMI com antibióticos a cada poço. Use uma pipeta multicanal para misturar suavemente e transferir 100 microliters para cada poço de uma nova placa de fundo redondo de 96 poços.
Coloque uma dessas duas placas duplicadas na incubadora. Use a segunda das novas placas duplicadas para citometria de fluxo, adicionando primeiro cinco microliters de PMA/Ionomicina Master Mix por poço, para estimular as células. Incubar por 24 horas e preparar as células para citometria de fluxo, conforme descrito no texto.
Adsia todas as células únicas viáveis com base no tamanho da dispersão para a frente e para o lado. Analise a expressão genética do repórter fluorescente por citometria de fluxo. Para selecionar clones unicelulares por PCR, os primers de design P5 e P6 para a triagem de PCR com base na sequência de repórteres escolhida, para amplificar 500 a 800 pares base da sequência de repórteres.
Para controle positivo PCR, primers de design P7 e P8 que amplifica 630 pares de base de um lócus genômico de tipo selvagem e não-direcionado. Projete um terceiro par de primer que amplifica 500 a 600 pares de base da espinha dorsal do vetor de alvo como um controle para integração inespecífica de sequências de backbone de vetor de alvo. Uma vez que os clones na segunda placa duplicada tenham crescido suficientemente, prepare-os para a triagem pcr pela primeira centrifugação da placa por 10 minutos a 300-G à temperatura ambiente.
Retire cuidadosamente o supernasce, certificando-se de não perturbar a pelota celular. Lave as células com 100 microliters de PBS por tubulação suave, centrifugando a placa por cinco minutos a 300 G à temperatura ambiente. Remova o PBS e adicione 200 microliters de tampão de lise por poço.
Pipeta suavemente para misturar e transferir a suspensão para uma nova placa PCR. Sele a placa com filme de parafina e incubar por uma hora a 55 graus Celsius em um termociclador. Depois de centrifugar detritos celulares em velocidade máxima por 10 minutos, transfira o supernatante para uma nova placa PCR.
Adicione 10 microliters deste lysate celular a cada poço de uma placa PCR de 96 poços cheia com 110 microliters de H2O destilado, por poço. Em seguida, incubar por 10 minutos a 99 graus Celsius em um termociclador, para inativar proteinase K.Use 2 microliters deste lysate celular como modelo e use uma mistura comercial pcr master para triagem, controle e BACKBONE PCR. Execute PCR para 38 a 40 ciclos de amplificação PCR em um formato de 96 poços.
Use cinco microliters de produtos PCR e execute-os em um gel TAE de 1,5% para analisar e combinar os resultados de citometria de fluxo e PCR, para confirmar clones de células únicas. A expressão genética do repórter após a indução de PMA/Ionomicina foi confirmada tanto pela citometria de fluxo quanto pela PCR em quatro a 12% das células, dependendo do local de integração. A análise pcr do DNA genômico usando primers para junção de integração de cinco prime e três primes, confirmam que os eventos de alvo ocorreram.
Após a triagem de clones de células únicas para direcionamento correto por citometria de fluxo, foram observados clones com expressão genética de repórteres alto, baixo e sem expressão genética fluorescente. Clones de células únicas também foram confirmados pelo PCR usando primers específicos para repórteres e primers de controle. Clones confirmados positivos na triagem PCR foram gastos e ainda analisados para o direcionamento correto pela mancha sulista, usando uma sonda específica para repórteres e uma sonda genômica de ligação fora do repórter.
Apenas uma porção mostrou tamanhos corretos de banda na análise de manchas do Sul e tinha enfatizou heterozygously o repórter, mostrando que é importante verificar os resultados da PCR pela mancha sulista. Clones também foram analisados por sequenciamento para confirmar ainda mais clones positivos unicelulares. Sequenciamento do local alvo:alelo homólogo, se o repórter não tivesse integrado, revelou mutações induzidas por Cas9.
Uma vez dominada, a geração de linhas de repórteres do HIV pode ser realizada em dois ou três meses. Antes de segmentar, é importante gastar tempo suficiente escolhendo um site de integração e repórter apropriado, dependendo da pergunta de pesquisa que você gostaria de abordar. Os repórteres podem, por exemplo, incluir diferentes elementos regulatórios do HIV, se desejar.
Após esse procedimento, as linhas de celular podem, por exemplo, ser usadas para testar o efeito de diferentes agentes de elevação da latência na atividade transcricional do TR repórter, dependendo do seu site de integração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar linhas de repórter hiv específicas do local de integração para projetar RNAs guia e segmentar vetor, realizar engenharia de genoma baseada em CRISPR/Cas9 em células jurkat, produzir clones de células únicas e selecionar para clones direcionados corretamente por facs e triagem PCR. Não se esqueça, que se você optar por trabalhar com um repórter de HIV competente para replicação, você precisa trabalhar sob condições de segurança BSL3.
