Name: isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains at JoVE.com

Agradecemos o Dr. Claire Davis e Dr. Miron Veronique (a rainha Instituto de investigação médica, Edimburgo, Kingdome Unidos) pela ajuda inicial e discussões sobre a abordagem experimental, a estrutura de classificação de células e a citometria de fluxo QMRI. Este trabalho foi apoiado por um Cancer Research UK carreira estabelecimento Award para Dr. Dirk Sieger.

1. amostra e preparação de meios de comunicação
<ol><li>Prepare o suporte de embrião (E3) pela dissolução de 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O em H2O.</li>
	<li>Colete embriões zebrafish imediatamente após a fertilização (0 dpf).<ol>
<li>Dividi o zebrafish embriões em 50 por prato de petri de 90 mm. Criar embriões a 28,5 ° C em 50 mL de meio de embrião (E3) tratado com 200 µM 1-fenil-2-tioureia (PTU), do final do primeiro dia do desenvolvimento (0 dpf) para a duração do experimento para inibir a pigmentação.</li>
		<li>Muda o E3 + médio PTU diariamente para a duração do experimento.</li>
		<li>Tela mpeg1:eGFP e larvas de NBT:DsRed no dpf 2 usando um microscópio fluorescente para a expressão do transgene positivo, macrófagos GFP+ /microglia e DsRed+ neurônios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparem-se todos os meios no dia anterior o experimento sob uma capa de cultura de tecidos para evitar a contaminação e, em seguida, armazene-os em 4 ° C.<ol>
<li>Preparar a mídia A dissolvendo Hepes de 15 mM e 25 mM D-glicose em HBSS 1 x.</li>
		<li>Prepare o médio gradiente de densidade (100%) misturando 9 volumes do meio de gradiente de densidade de 1 volume de HBSS 10 x.</li>
		<li>Prepare o suporte de gradiente de densidade (22%) diluindo 22 mL de meio de gradiente de densidade (100%) em 88 mL de DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparar DPBS 1 x.</li>
		<li>Prepare E3 médio + tricaina misturando E3 médio com 450 μM tricaina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogeneização
Nota: Todas as etapas são realizadas 4 ° C.
<ol><li>Adicione 1,5 mL metanosulfonato (15 mM) de 90 mm placas de Petri contendo 50 larvas em 50 mL de meio de embrião E3 tratado com 200 µM PTU para anestesia terminal.<ol>
<li>Puxa-saco 10 larvas anestesiadas desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso.</li>
		<li>Larvas de transferência anestesiada 10 por 10 em uma placa de Petri 55mm repleto de gelada médio de embrião de E3 + tricaina.</li>
		<li>Sob um estereomicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da caixa de Petri. Então transecto larvas cabeças acima o saco vitelino-usando microtesoura cirúrgica (excluir a bexiga natatória para evitar flutuação cabeças).</li>
		<li>Puxa-saco cabeças desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso. Espere até que todas as cabeças se reúnem dentro a ponta da pipeta e em seguida, transferi-los para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL gelada Media A (transferência em um volume mínimo para reduzir a mídia uma diluição por E3 + tricaina). Manter o homogenizador de vidro no gelo. Use um homogeneizador por condição experimental.</li>
		<li>Substituir cada pequeno prato de petri contendo gelo frio E3 + tricaina com um novo cada 30 min para assegurar essa transecção é executada no frio E3 + tricaina médio.</li>
		<li>Substitua o gelado A mídia no homogenizador de vidro quando a cor começa a desvanecer-se. Nota: Diluição de A mídia pode alterar o tecido cabeça devido a mudanças de temperatura.</li>
		<li>Uma vez que todos os chefes foram coletados (600 cabeças/condição), remover o volume máximo da mídia A partir do homogenizador de vidro e substituí-lo com 1 mL da gelada fresco Media.</li>
		<li>Perturbar o tecido do cérebro com um homogeneizador de vidro apertado no gelo. Execute 40 rodadas de esmagamento e voltas para larvas de dpf de 3-5 e 50 para larvas de dpf 7 e 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 2 mL da mídia à suspensão de células (1 mL A de mídia / 200 cabeças), que irá diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina para facilitar sua separação durante a centrifugação em gradiente médio de densidade.<ol>
<li>Para eliminar a aglomeração de célula, execute a suspensão de células através de um filtro de célula de 40 µm colocado em cima de um tubo de Falcão frio 50ml mantido no gelo. Repita esta operação 3 vezes.</li>
		<li>Transferir 1 mL da suspensão de células para tubos de frio 1,5 mL e girá-los a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Remover o sobrenadante utilizando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ressuspender o centrifugado com 1 mL de meio de gradiente gelada 22% densidade levemente sobreposto por 0,5 mL de DPBS gelada 1 x (do não mistura-los, uma interfase entre ambas as soluções serão vistos).<ol>
<li>Girar os tubos em 950 g sem freio e aceleração lenta por 30 min a 4 ° C. Nota: Este passo separa a mielina de outras células pelo sequestro de no período do intérfase de DPBS 1 x e 22% médio gradiente de densidade, Considerando que células serão sedimento no fundo do tubo. Remoção de mielina é mais eficiente quando a concentração de célula não é muito alta.</li>
		<li>Usando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 ' descartar o máximo de DPBS, médio gradiente de densidade e mielina preso na sua interfase.</li>
		<li>Lavam-se células com 0,5 mL da mídia A + 2% de soro de cabra normal (NGS) e, em seguida, girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descartar o máximo do líquido sobrenadante e, em seguida, juntar todos os chumbos de célula da mesma condição experimental junto em 1 mL de mídia A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se as células de interesse expressam uma proteína fluorescente como macrófagos/microglia de mpeg1:eGFP ou neurônios de NBT:DsRed peixe transgénicos (screening de peixe transgénicos ver 1.1.3), executar a suspensão de células através de um filtro de célula de 35 µm cap e transferi-los para uma tubos de frio 5 mL FACS no gelo, protegidos da luz. Nota: Alternativamente, a imuno-coloração da microglia pode ser executada.</li>
</ol>3. Microglia Immuno-coloração
Nota: Todas as etapas são executadas a 4 ° C.
<ol><li>Ressuspender o centrifugado com 0,3 mL de mídia A + 2% NGS. Dividi-los em tubos de 3 x 1.5 mL: um para células imaculadas medir a autofluorescência de células de interesse, em segundo lugar para o anticorpo secundário (1/200) medir a ligação não-específica do anticorpo secundário para microglia e, terceiro, como um teste (4 4 mouse monoclonal anticorpo (microglia específico) (1/20) + (1/200) de anticorpo secundário).<ol>
<li>Adicione baixa endotoxina, livre de azida sódica (folha) em 1% para as células (todos os tubos) para bloquear CD16/CD32 interações com o domínio do Fc de imunoglobulinas. Incube as células por 10 min com agitação suave cada 5 min.</li>
		<li>Adicionar 4 a 4 anticorpo (1/20) para as células (tubo 3) e incube por 30 min com agitação suave a cada 10 min.</li>
		<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave uma vez com 0,5 mL da mídia A + 2% NGS, então girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender o centrifugado com 0,5 ml de mídia A + 2% NGS e incubar as células com folha em 1% por 10 min com agitação suave cada 5 min.</li>
		<li>Adicione o anticorpo secundário (1/200) para as células (tubo 2 e 3). Incube as células por 30 min com agitação suave cada 10 min e protecção leve.</li>
		<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave duas vezes com 0,5 mL de mídia A + 2% NGS, então a re-suspender centrifugado com 1 mL de mídia A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar a suspensão de células através de uma tampa de filtro de célula µm 35 e transferi-los para tubos de 5ml frio FACS no gelo, protegido da luz.</li>
</ol>4. célula de triagem (FACS)
Nota: Executar todas as etapas, a 4 ° C.
<ol><li>Classificar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia usando um FACS. Nota: Esta etapa é geralmente realizada por um membro do pessoal da instalação de FACS e configurações dependem do tipo de equipamento utilizado.<ol>
<li>Adicione DAPI em uma concentração de 1 µ g/mL em cada tubo de FACS para rotular as células mortas.</li>
		<li>Configurar o FACS e tipo de neurônios, macrófagos/microglia ou microglia de todas as células do cérebro. Separar células de detritos em função do seu tamanho e granulosidade e, em seguida, single-células por dispersão para a frente e dispersão do lado da porta. Exclua células mortas por DAPI rotulagem de células vivas. Identifica os neurônios, macrófagos/microglia ou microglia por seus respectivos coloração positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolher pilhas em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de gelado A mídia + 2% NGS em gelo. Use tubos diferentes para cada tipo de célula.<ol>
<li>Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave uma vez com 0,5 mL de mídia A então descartar o sobrenadante no máximo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. extração do RNA
<ol><li>Extraia o RNA dos diferentes tipos de células separados por FACS. Para a extração de RNA usar um kit específico e siga as orientações do fabricante. Certifique-se para trabalhar em um ambiente livre de RNase por pipetas com um produto de descontaminação de RNase e limpeza do espaço de trabalho e usar filtro dicas.<ol>
<li>Recentemente Prepare-se 1 mL de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Nota: Aqui, β-Mercaptoetanol é adicionado para reduzir a degradação de RNA.</li>
		<li>Prepare a solução de etanol 70% e 80% usando RNase água livre.</li>
		<li>Lyse pilhas com 75 µ l de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Em seguida, use uma máquina trituradora para melhorar o rompimento da pilha.</li>
		<li>Continue manual de extração de RNA de acordo com o fabricante.</li>
		<li>No final do protocolo, Eluir o RNA com 14 µ l de água livre de RNase para obter uma concentração suficiente de RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. 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Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo experimental descrito aqui representa um método robusto e eficiente para isolar as células do cérebro de zebrafish larvas de 3 a 8 dpf. Importante, este é o primeiro protocolo que permite o isolamento específico da microglia do zebrafish larval cérebros. O protocolo é projetado para preservar a integridade da membrana celular e para minimizar possíveis modificações da expressão genética ocorrem durante o processamento. Este último ponto é crucial para a relevância dos resultados com base na análise desses perfis genômicos celulares isolados. Com efeito, polarização microglia e macrófagos são fortemente influenciados pelo seu microambiente. A 37 ° C, estas células teria mudado seu perfil de expressão de gene em resposta a condições experimentais (resposta de lesão (transecção)). Portanto, foi crucial para realizar este experimento a 4 ° C antes da extração de RNA, para retardar processos celulares e atividades metabólicas. Além disso, a homogeneização do tecido de cérebro mecânico a 4 ° C foi escolhida em vez de digestão enzimática do tecido a 37 ° C para evitar qualquer impacto sobre perfis de expressão de gene.
É importante salientar que este método é muito rápido; dentro de um dia de várias populações de células do cérebro podem ser isoladas de pelo menos duas diferentes condições experimentais e seu RNA extraído. O comprimento total do protocolo depende do número de larvas usados para cada condição como a transecção de cabeças larvas é o passo limitante (∼ 350 cabeças/h). Em geral, para trabalhar com microglia de 3, 5 e 7 dpf é aconselhável transecto 600 cabeças ∼ por teste para obter suficiente RNA para extrair (tabela 1). Como micróglia representam o tipo de célula com o menor rendimento (aproximadamente 112 células per capita no dpf 7), o número de cabeças pode ser reduzido para outros tipos de células, incluindo os macrófagos (aproximadamente 170 células per capita em 7 dpf).
Outra vantagem deste protocolo é que, uma vez que se estabeleceram as configurações no classificador de FACS, as mesmas configurações podem ser usadas para diferentes experiências. Tem sido observado que populações de células se encaixam perfeitamente de um experimento para outro com portões previamente concebidos, mostrando a reprodutibilidade de experimentos usando esse método.
Uma ligeira desvantagem desse método é a relativamente baixa quantidade de RNA que é colhido. No entanto, esta limitação é mais uma questão biológica do que um problema técnico, como o número de micróglia é muito baixo em estágios iniciais de desenvolvimento do cérebro (tabela 1). Por causa desta baixa quantidade de RNA coletado, etapas de amplificação precisam ser considerados para executar análise de expressão de gene ampla do genoma. Felizmente, estas etapas de amplificação produzem quantidades suficientes de cDNA de alta qualidade. Assim, mudanças globais nos perfis de expressão do gene de células isoladas podem ser estudadas.
Em conclusão, este protocolo fornece um método robusto para isolar e estudar vários tipos de células do CNS de cérebros de zebrafish larval. Isto pode ser aplicado para ganhar uma compreensão mais profunda dessas células durante o desenvolvimento, bem como para estudar o seu papel na doença.

Conhecimento sobre o desenvolvimento do cérebro e doenças cerebrais melhorou significativamente na última década desde a primeira quantificação de cérebro de rato transcriptomes1. Com efeito, análise de expressão de gene ampla do genoma nos dá acesso para detalhadas informações genéticas no tecido cerebral e as células que podem complementar e melhorar as observações feitas com outras técnicas e ferramentas.
O peixe-zebra é um potente modelo biológico, fáceis de criar e modificar geneticamente; sua transparência óptica em estágios larvas permite de observações de imagens ao vivo2. Infelizmente, em comparação ao humano e mouse, o número de anticorpos disponíveis para executar imuno-coloração é um pouco baixa. Para corrigir isso, linhas de peixe zebrafish transgênicos são feitas facilmente modificando geneticamente o peixe para expressar proteínas fluorescentes sob os promotores específicos de tipo de célula. Linhas de zebrafish transgênicos têm sido utilizadas no passado para estudar o papel de macrófagos e microglia durante o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) e doença3,4,5,6. No entanto, para obter uma compreensão detalhada destes processos, precisamos entender mudanças na expressão gênica nos tipos de célula respectivos. Para esse fim, nós desenvolvemos um método experimental para isolar especificamente células como os neurônios, macrófagos e microglia de 3 a 8 dias cérebros de zebrafish larval pós fertilização (dpf). Para o estabelecimento do protocolo, trabalhamos com linhas de peixe transgênico que expressam a proteína verde fluorescente (GFP) em macrófagos/microglia sob o macrófago-expressa o gene promotor (mpeg1:eGFP) e DsRed nos neurônios sob a ß-tubulina neural promotor (NBT:DsRed)7,8,9. Além disso, realizamos imuno-coloração de micróglia usando 4 4, um anticorpo monoclonal de rato que especificamente manchas zebrafish microglia10,11. Depois, ácido ribonucleico (RNA) é extraído dessas células para mais quantitativas cadeia da polimerase (qPCR) ou análises de transcriptoma. Este protocolo foi projetado para homogeneizar eficientemente o tecido cerebral de zebrafish larvas; coletar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia sem alteração de sua integridade de membrana plasmática e finalmente extrair RNA destas células em alta qualidade (RIN > 7) e a quantidade para executar análise genômica. Ao contrário de estudos anteriormente publicados que usam o tratamento de tripsina a 37 ° C para digerir o cérebro tecido12,13, este protocolo promove o trabalho em 4 ° C até a etapa de extração de RNA para reduzir as modificações do perfil de expressão do gene. Esta etapa é crucial como microglia e os macrófagos são células altamente sensíveis que respondem às mudanças em seu microambiente imediatamente, alterando seu gene expressão perfil e polarização14,15, 16.
O protocolo, aqui descrito em detalhe, mostra que o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros, mas virtualmente, pode ser adaptado a qualquer outra célula presentes dentro do cérebro - usando linhas de peixe transgénicos ou rotulados com anticorpos específicos. Este método irá permitir uma melhor caracterização das células CNS através de suas análises de expressão de gene ampla de genoma e ajudará a compreender o seu papel durante o desenvolvimento e doenças cerebrais.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 90mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Surgical micro-scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Glass homogenizer</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 55mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylen conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Needle 23G x 1&#039;&#039;</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m cell strainer cap</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

Para obter uma compreensão detalhada do papel de células diferentes do CNS durante o desenvolvimento ou o estabelecimento e progressão do patologias do cérebro, é importante isolar essas células sem alterar seu perfil de expressão do gene. O modelo de zebrafish fornece um grande número de linhas de peixe transgênico em que tipos de células específicas são rotulados; por exemplo, neurônios na linha de NBT:DsRed ou macrófagos/microglia na linha de mpeg1:eGFP. Além disso, os anticorpos têm sido desenvolvidos para manchar a células específicas, tais como microglia com o 4-4 anticorpo.
Aqui, descrevemos o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros. Central para este protocolo é evitar uma digestão enzimática do tecido a 37 ° C, o que poderia modificar perfis celulares. Em vez disso, é usado um sistema mecânico de homogeneização do tecido a 4 ° C. Este protocolo envolve homogeneização dos cérebros em suspensão de células, sua imuno-coloração e o isolamento de neurônios, macrófagos e microglia por FACS. Depois, extraído do RNA essas células e avaliada a sua qualidade/quantidade. Conseguimos obter RNA de alta qualidade (número de integridade do RNA (RIN) > 7) para realizar qPCR em análise macrófagos/microglia e neurônios e transcriptomic na microglia. Essa abordagem permite uma melhor caracterização destas células, bem como uma compreensão mais clara sobre o seu papel no desenvolvimento e patologias.

O protocolo descrito é uma abordagem simples para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros. A partir desses isolados de células, uma quantidade significativa de alta qualidade (RIN > 7) RNA foram extraídos. O objectivo do presente protocolo é isolar diferentes tipos de células do SNC, com mínima modificação do seu perfil de expressão do gene para analisar e caracterizar as funções e propriedades da célula. Portanto, o protocolo inteiro é realizado a 4 ° C, com uma homogeneização do tecido de cérebro mecânico. Este método tem sido utilizado com sucesso para dois estudos realizados em laboratório. No primeiro estudo, os neurônios e macrófagos/microglia foram isoladas de 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larva (Figura 1). FACS permitida a separação da pilha de detritos em função do seu tamanho (FSC-A) e granularidade (SSC-A) (Figura 1A). Células únicas foram então separadas de parelhas ou aglomerados de células (Figura 1B). Da população única célula, um portão foi desenhado para eliminar as células mortas (DAPI+). O enredo de ponto correspondente revelou que este protocolo experimental preserva a integridade da membrana plasmática celular, como a taxa de células mortas é apenas 26,7% (Figura 1C). Finalmente, neurônios (DsRed+) e macrófagos/microglia (GFP+) eram facilmente separavam os portões de população de células vivas. A população de neurônio (23,1%) parecia ser mais proeminente do que a população de macrófagos/microglia (1,56%) dentro do cérebro (Figura 1D). Este protocolo permitiu para isolar o RNA dessas células para realizar análises subsequentes qPCR para comparar a expressão de genes específicos entre os neurônios e macrófagos/microglia. A Figura 2 mostra neuronal e os níveis de expressão do gene de macrófagos/microglia do antígeno nuclear de proliferação celular (pcna)contra gene β-actina domésticas, por exemplo.
O segundo estudo este método focado em microglia isolamento de 3, 5 e 7 dpf cérebros larval. Em contraste com o experimento descrito acima, as células foram isoladas por imuno-coloração usando 4 4, um anticorpo que rotula especificamente microglia (Figura 3 A-D). Como descrito anteriormente, microglia (4 4+) foram selecionados a partir de células vivas e coletados (Figura 3-D). Microglia números dentro zebrafish larval cérebros são variáveis (tabela 1) e muito baixa no dpf 3 (∼ 25 por peixes). Qualidade e quantidade de RNA extraído dessas células foram medidos utilizando um sistema de eletroforese capilar micro baseado. Resultados obtidos do RNA extraído de micróglia 5 dpf zebrafish larval cérebros foram fornecidos para ilustrar um exemplo de análise de RNA (tabela 1 (dpf 5; experimento 4)). A Figura 4 mostra o rastreamento de eletroforese e sua representação gráfica obtidos para esta amostra com uma visualização clara do RNA ribossomal (28s e 18s). Estes dados são necessários para calcular a amostra RIN e determinar a concentração de RNA. A tabela 1 resume o número de isolados microglia por peixes, a quantidade de RNA por microglia e o escore de RIN obtido para cada experimento diferente em 3, 5 e 7 dpf. A quantidade e a qualidade do RNA extraído de micróglia isolado usando este método permitiram a amplificar o RNA em cDNA usando um kit. Testes de qualidade e quantidade fornecidos por Edimburgo genómica confirmam que o cDNA amplificado de qualidade suficiente para a preparação de biblioteca e posterior sequenciamento. A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho de fragmentos de cDNA e sua quantidade medido utilizando um sistema eletroforético. Neste exemplo, o cDNA tinha um tamanho médio de 299bp em uma concentração de 36100 pmol/l. tabela 2 ilustra, respectivamente, qualidade e quantidade de testes feitos no cDNA amplificado de amostras do RNA (tabela 1 (dpf 5; experimento 4)). O cDNA amplificado tem sido usado com sucesso para o sequenciamento.
Vários estudos realizados em laboratório confirmaram que a qualidade e a quantidade de RNA extraído de neurônios, macrófagos e microglia podem ser usados para qPCR subsequente e as análises de expressão de gene ampla do genoma. Portanto, este protocolo experimental pode ser usado para isolar confiantemente diferentes tipos de células do CNS sem alterar sua integridade de membrana e limitando a modificação do seu perfil de expressão do gene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Figura 1 : FACS 8 dpf zebrafish larvas de classificação para os neurônios e macrófagos/microglia do /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ . (A-C) Gating sucessivas mostra seleção sequencial de todo cérebro células (A), dispersão de células únicas por dispersão para a frente e lateral (B). Células (C) mortos foram excluídas pela rotulagem DAPI. (D) os neurônios e macrófagos/microglia foram identificados respectivamente pela coloração positiva DsRed e GFP. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Figura 2 : Análise de expressão do Gene para pcna e β-actina nos neurônios e macrófagos/microglia. RNA de neurônios isolados e macrófagos/microglia pode ser transcrito em cDNA para uso em análises quantitativas de PCR. níveis de expressão de RNAm de pcna contra gene β-actina domésticas em neurônios isolados e macrófagos/microglia determinado pelo qPCR (N = 3). Mudança de dobra foi medida utilizando o método comparativo (ΔΔCT). Erro da barra representam média ± SEM. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Figura 3 : FACS classificação para microglia de 3 larvas de zebrafish dpf. (A-C) Sucessivas sequencial Mostrar seleção associada do cérebro todas as células (A), dispersão de células únicas por dispersão para a frente e lateral (B). Células (C) mortos foram excluídas pela rotulagem DAPI. (D) Microglia foram identificados por 4 4 coloração positiva. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Figura 4 : Resultados de eletroforese capilar-micro do RNA extraído das 5 dpf zebrafish microglia. Os dois picos altos são o RNA ribosomal 18S e 28S. Número de integridade do RNA (RIN) foi calculado automaticamente pelo software bioanalyzer usando a relação gerada da 18S e 28S subunidades ribossomais e a análise do rastreamento eletroforética inteira. Microglia RNA tem um RIN 8,6. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Figura 5 : Testes de qualidade e quantidade do cDNA amplificado de amostra de RNA de 5 dpf zebrafish microglia. A imagem mostra a distribuição de tamanho de fragmento do cDNA da amostra analisada com um tamanho médio de 299 BP <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Condição</td>
			<td>Experimento</td>
			<td>Número de peixes</td>
			<td>Número do celular</td>
			<td>Número de células por peixes</td>
			<td>Concentração de RNA (pg/ul)</td>
			<td>RNA total (pg)</td>
			<td>Quantidade de RNA por célula (pg)</td>
			<td>Pontuação de RIN</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17,03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0,10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19,94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0,26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54,18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0,09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0,06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0,06</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo de isolamento microglia e dados de extração de RNA de 3, 5 e 7 dpf zebrafish larvas.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ID de amostra interna</td>
			<td>ID de amostra externo</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>Concentração média (ng/ul)</td>
			<td>Volume (ul)</td>
			<td>UG recebido</td>
			<td>Aprovação/reprovação para concentração mínima</td>
			<td>Aprovação/reprovação para quantidade de minimim</td>
			<td>Aprovação/reprovação para quantidade recomendada</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (experimento 4)</td>
			<td>58,8</td>
			<td>58,4</td>
			<td>58,6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>Passar</td>
			<td>Passar</td>
			<td>Passar</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Requisitos de amostra para a preparação da biblioteca:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biblioteca Prep</td>
			<td>Quantidade mínima (ng)</td>
			<td>Quantidade recomendada (ng)</td>
			<td>Mínima concentração ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano gel biblioteca inserção livre bp 350 de cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Testes de quantidade de cDNA amplificado de amostra de RNA de 5 dpf zebrafish microglia.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K visualizações.  University of Edinburgh. Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Neurociência

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Biologia

Processamento de células intestinais de larvas de peixe-zebra para sequenciamento de RNA de célula única

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autor em destaque: isolando e analisando células intestinais de larvas de peixe-zebra para investigar aspectos transcriptômicos do desenvolvimento gastrointestinal 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Brain Cell Isolation from Zebrafish Larvae: A Technique to Obtain Intact Neurons, Macrophages, and Microglia from Zebrafish Brain Tissue

Source: Mazzolini, J. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57431/isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval">Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a protocol to isolate neurons, macrophages, and microglia from larval zebrafish brains by mechanically disrupting the brain tissue. The purified cell populations can further be used for genomic analysis.

Isolamento de células cerebrais de larvas de peixe-zebra: uma técnica para obter neurônios, macrófagos e microglia intactos do tecido cerebral do peixe-zebra

Source: Mazzolini, J. et al. Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains. J. Vis. Exp. (2018)
This ...

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Isolamento de células cerebrais de larvas de peixe-zebra: uma técnica para obter neurônios, macrófagos e microglia intactos do tecido cerebral do peixe-zebra