Name: spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Agradecemos a Paul O'Brien, Marizel Mina e Isabella Freedman para experiências em animais, Jacquie Gonzalez e Danielle Weiner do NIH/NIAID para ajuda com irradiação gama de tecidos coelho antes do laser captura microdissection e Jansy Sarathy para manuscrito pensamentos e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo financiamento do Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1174780) e instrumentação de NIH compartilhado concedem 1S10OD018072. Agradecemos Eliseo A. Eugenin fornecendo acesso para microscópio Leica LMD 6500 e partilha de conhecimentos e conselhos. A compra e suporte contínuo, o LMD 6500 foi financiado por grant o Instituto Nacional de Saúde Mental, MH096625, o Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso, NS105584, PHRI financiamento (E.A.E) e GSK contribuições (E.A.E).

Todos os animais foram realizados estudos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório dos institutos nacionais de saúde, com aprovação do cuidado Animal institucional e Comissão de uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animais experimentos e coleta de tecido
Esta seção do protocolo descreve procedimentos de animais e coleta de amostra em condições de biossegurança nível 3 (BSL3). Protocolos detalhados da Mycobacterium tuberculosis aerossol infecção procedimento droga administração e protocolos em coelhos tem sido descrito anteriormente11,12.
<ol><li>Infectar coelhos Nova Zelândia branco (masculinos e femininos em 4-5 meses de idade) com M. tuberculosis HN878 usando um sistema aerossol somente nariz, conforme descrito anteriormente11.</li>
	<li>Administrar as drogas escolhidas (etambutol no exemplo apresentado aqui) através da rota preferencial e eutanásia dos animais em 2, 6 e 24 h após a administração. Primeiro, anestesia o coelho por injeção intramuscular de cetamina em 35 mg/kg e xilazina 5 mg/kg. Espere dez minutos e confirme anesthetization adequada beliscar a cauda e tocando suavemente o olho. Se não há nenhuma reação, eutanásia por administração intravenosa de pentobarbital e fenitoína (ver Tabela de materiais) em 1 mL/4,5 kg em soro fisiológico estéril de 2 mL. Nota: Esses momentos são ideais para cobrir o perfil farmacocinético para Ethambutol e podem exigir ajuste/otimização para outras drogas de estudo.</li>
	<li>Usando a pinça, tesoura ou bisturi, remover os pulmões da cavidade torácica, ressecar biópsias pulmonares contendo grandes granulomas necróticos incorporados no tecido de pulmão não envolvido (conforme descrito anteriormente,3). Necróticos granulomas aparecem bege na cor e normalmente projetam-se ligeiramente do pulmão circundante cor vermelho/rosa. Para facilitar a fácil cryosectioning, certifique-se de que as biópsias são não maiores que 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Usando a pinça, coloque a biópsia em uma bandeja de cryomold pre-etiquetados com a superfície de corte desejado em contato direto com a base da bandeja. Após a congelação, isso proporcionará uma superfície plana do qual cryosections será cortado.</li>
	<li>Congele a biópsia em vapor de nitrogênio líquido. Encha um recipiente de isopor a uma profundidade de 2 polegadas com nitrogênio líquido e coloque uma cremalheira de fio do metal do tubo. O rack deve projetar-se acima da superfície do nitrogênio líquido proporcionando uma superfície plana sobre a qual são colocadas as bandejas de tecido. Coloque a tampa de volta no recipiente de isopor e deixar tecidos durante 10 minutos para congelar completamente.</li>
	<li>Remova as bandejas de tecido, rapidamente, embrulhe em película de alumínio e coloque em rotuladas individualmente selo e sacos plásticos resealable. Transfira para o congelador-80 ° C para armazenamento. Nota: Etapas 1.1-1.6 são executadas em condições BSL3 (incluindo todo o trabalho animal e manipulação de tecidos e órgãos infectados). Gama irradiar as biópsias pulmonares em 3 megarad para habilitar o tratamento fora do confinamento do BSL3. Microdissection de captura do laser no tecido esterilizado pode ser realizado dentro do BLS3 facilidade se aprovados os protocolos de segurança estão em vigor. No entanto, o restante do presente protocolo descreve o processamento a jusante em uma facilidade BSL-2.</li>
</ol>2. tecido de seccionamento
<ol><li>Conjunto do criostato para a temperatura de corte desejada. Transferir a biópsia de pulmão gama irradiados de armazenamento-80 ° C para o criostato e deixar por 30 minutos para equilibrar a temperatura do tecido. Nota: -20 a-22 ° C é ideal para biópsias de lesão TB.</li>
	<li>Usando uma pinça, conserte a biópsia para o chuck criostato usando uma pequena quantidade de adesivo de temperatura de corte ideal (OCT) para aderir a base do tecido para o chuck. Posicione o tecido de modo que a superfície plana (que estava em contato com a base do cryomold) é a superfície exposta para o corte. Garantir a OCT não contamina a superfície do tecido, como isso pode interferir com a análise de espectrometria de massa subsequente.</li>
	<li>Três seções de tecido em 25 µm de espessura de corte e montagem no PET membrana slides. Suavemente, toque a membrana para a seção de tecido e remover. Se muita pressão é aplicada, a fina membrana pode rasgar.<ol>
<li>Evite o manuseio excessivo dos slides antes da montagem, pois isso resultará na membrana de PET, tornando-se carregada e pobre adesão das secções de tecido. Certifique-se de que o slide de membrana é mantido à temperatura ambiente para permitir a adesão de degelo-montagem e bem sucedida do tecido à membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirar a lâmina do criostato e deixe para secar por 3 minutos. Se LCM-LC/MS/MS não será executada imediatamente, sele o slide em um pequeno saco selável hermético e transferência para armazenamento-80 ° C até necessária para dissecação.</li>
	<li>Corte uma parte adjacente em 10-12 µm e degelo-mount em um slide de vidro padrão de hematoxilina e eosina (H & E) coloração e referência. Seções adicionais podem ser cortadas neste momento para outras manchas de histoquímica desejado (como o Ziehl-Niellsen para a visualização de Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Retire o saco selado que contém o slide de armazenamento-80 ° C e deixe para atingir a temperatura por 5 minutos. Nota: Se o frio slide imediatamente é exposto à atmosfera de laboratório, o tecido irá tornar-se revestido com condensação, e a integridade espacial da droga pode ser comprometida.</li>
	<li>Ligue o microscópio e laser (laser requer 5-10 minutos de aquecimento antes de corte pode começar). Carregar tubos PCR 0,20 mL liso-cap para o titular.</li>
	<li>Retirar a lâmina do saco e levar uma imagem óptica da seção de tecido no slide PET usando um scanner de mesa.</li>
	<li>Coloque o slide no porta corrediça (lado do tecido voltada para baixo) e atribuir os tubos de coleta seletiva para regiões específicas granuloma de interesse usando o software de microscópio. Normalmente, estes serão 'sem envolvimento pulmonar,' 'granuloma celular', e 'caseum' (centro necrótico), mas pode variar dependendo da patologia específica da biópsia/granuloma.</li>
	<li>Focar o tecido usando o 5 X objetivo de microscópio. Essa ampliação deve fornecer uma boa visão do tecido que contém ambas as áreas de granuloma necrótico e celular. No software selecione o tubo designado 'caseum' para movê-lo para a posição sob o tecido.</li>
	<li>Digite os parâmetros desejados de dissecação. As configurações típicas para uma seção de pulmão grosso 25 µm são poder do laser 30, velocidade 15 e abertura 35 (unidades arbitrárias). No entanto, estas serão diferentes dependendo do microscópio usado e potencial declínio de poder devido à idade do laser.</li>
	<li>Selecione a ferramenta de 'desenho livre' e, usando caneta touchscreen ou um rato, contorne a região desejada para dissecação. A área de superfície da região será exibida no software. Regiões selecionadas sob 500.000 µm2 (0,5 mm2) para facilitar a dissecação mais fácil de manter. Repita a dissecação até 3 milhões µm2 (3 mm2) têm sido recolhidas no total na tampa do tubo.<ol>
<li>Na ocasião, a região dissecada pode permanecer presa à membrana circundante (por exemplo, devido a atração estática) e não cair a tampa de coleção. Remova estas regiões de cumulativa área de superfície total selecionando e removendo manualmente dentro do software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione o boné para 'lesão celular' e coletar 3 milhões µm2 do tecido usando o mesmo processo, conforme descrito na etapa 3.7.</li>
	<li>Selecione o boné para 'sem envolvimento pulmonar' e coletar 3 milhões µm2 do tecido usando o mesmo processo, conforme descrito na etapa 3.7. Observe que o tecido pulmonar sem envolvimento contém muitos espaços alveolares e bronquíolos. Preste muita atenção para excluir estas provenientes das regiões de tecido definidos para dissecação.</li>
	<li>Retire o porta-tampa e cuidadosamente unclip, selar e etiquetar cada tubo. Protege os tecidos dissecados do entorno ar distúrbios (por exemplo, de interrupção de fluxo de ar de uma porta de abertura). Analisar os tecidos dissecados imediatamente, ou armazenar a-80 ° C e descongelar antes do processamento e análise LCMS.</li>
</ol>4. extração e análise LCMS
<ol><li>Prepare a solução de extração de 1:1 acetonitrilo/metanol contendo padrão interno d-10 de Etambutol. Ao selecionar um padrão interno, uso uma forma estável e rotulada da droga do analito (tais como deutério-rotulado EMB utilizado nesta demonstração) com deslocamento de massa suficiente para evitar o isótopo Cruz falar entre o analito drogas e padrão (geralmente um mínimo de 4 daltons) . Nota: Criar padrões em homogeneizado de cada tipo de tecido respectivos é difícil porque não há tecido controle muito limitado com o qual deseja criar normas homogeneizado. Como alternativa à disponibilização de normas de uma amostra de homogenate cravado, um padrão pode ser criado pela adição de tecido em branco e composto de teste junto e extração. Um volume de tecido de controle em um homogenate que coincide com o volume de destino das secções de tecido de amostra de estudo é combinado diretamente com o aumento do teste de compostos que estaria presente em uma dada concentração.</li>
	<li>Calcular o volume do tecido-alvo com base na área de superfície e espessura do tecido e determinar o factor de diluição necessária para o homogenate utilizando o volume de homogeneizado que será adicionado para o padrão e as amostras QC. Cálculos são ilustrados abaixo para uma área-alvo dissecado2 (3 mm2) µm 3 milhões com um 25 µm de espessura e 2 µ l volume de homogeneizado. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Assumindo uma densidade de tecido de 1 g/mL, prepare o estoque de homogeneizado, 50 mg de tecido de controle de pesagem e adição de tampão PBS para diluir (usando o fator de diluição de 26,67 homogenate calculado na etapa 4.2, o diluente é 1,283 mL). Homogeneizar por grânulo batendo o tecido pulmonar e tampão PBS durante 5 minutos em 1750 rpm em um homogeneizador de grânulo. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Dilua a concentração de estoques de drogas 1 mg/mL em acetonitrila/água de 1:1 para criar a curva padrão de cravação soluções. Determine concentrações padrão baseadas sobre o volume de pico e o volume de tecido alvo de cravação. O exemplo ilustrado é para um 100 ng/mL padrão usando um volume de pico 10 µ l. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Retirar os tubos contendo os tecidos microdissected de armazenamento-80 ° C e deixe para atingir a temperatura por 5 minutos.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de solução de acetonitrila/água 1:1 e 2 µ l de tampão PBS para os tubos contendo tecido microdissected.</li>
	<li>Para a curva padrão e controle de qualidade de tubos, adicione 10 µ l da solução a 2 µ l de controlo pulmão homogenate de cravação.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução de extração para cada tubo.</li>
	<li>Vórtice cada tubo por 5 minutos, proceda à sonicação por 5 minutos e centrifugar a 5000 RPM por 5 minutos para formar um pellet de filme e tecido em cada tubo.</li>
	<li>Transferir 50 µ l do sobrenadante para uma placa de 96 poços profundos poços e diluir com um adicional 50 µ l de água deionizada em cada poço.</li>
	<li>Realizar análise de LC/MS/MS usando parâmetros do instrumento otimizado para Ethambutol e etambutol-d10 padrão interno (conforme descrito em detalhe12).</li>
	<li>Use um fator de diluição para corrigir a quantidade exata de tecido dissecado para cada amostra. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. método validação
<ol><li>Crie um homogenate no tecido pulmonar de controle através da combinação de esferas de aço de 3-4, 2 partes de PBS e 1 parte de pulmão. Bata o tecido pulmonar e tampão PBS durante 5 minutos em 1750 rpm usando um homogenizador do grânulo.</li>
	<li>Spike o homogenate adicionando 10 µ l de 1 mg/mL estoque Ethambutol DMSO em 990 homogenate µ l para criar uma concentração final de 10.000 ng/mL (10 mg/mL) e vortex durante 1 minuto.</li>
	<li>Crie um bloco congelado homogeneizado derramando o homogeneizado em um cryomold e congelando rapidamente em gelo seco por 5 minutos.</li>
	<li>Prepare 25 µm espessura seções do bloco homogeneizado como descrito nos passos 2.1-2.5.</li>
	<li>Disse a área de tecido alvo conforme especificado nas etapas 3.2-3.10.</li>
	<li>Adicione 10 µ l 1:1 acetonitrila/água e 2 µ l de tampão PBS para os tubos contendo tecido microdissected.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução de extração para cada tubo. Siga os passos 4.9-4.12 para criar uma curva padrão e determinar a concentração de fármaco no bloco de homogeneizado de tecido.</li>
	<li>Calcule a eficiência de extração, usando a fórmula abaixo: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Espacialmente resolvidos de quantificação de drogas em lesões de TB pulmonares é necessária para determinar se a exposição da droga atinge esterilizantes concentrações de populações bacterianas que residem dentro dos compartimentos diferentes lesão. LCM-LC/MS método descrito aqui permite a quantificação absoluta de fármacos anti-TB dentro de todos os compartimentos de lesão, incluindo o caseum ricos em bactérias, usando apenas 1-3 seções de tecido no total. Homogeneização de tecidos tradicionais e abordagens de LC/MS para quantificação de drogas em tecido, muitas vezes faltam a especificidade espacial para resolver compartimentos específicos lesão e mesmo quando é possível, existe um potencial significativo de cruz contaminar celular e áreas de necrose da lesão durante o processo de extração manual.
A abordagem de LCM-LC/MS tem várias vantagens para espectrometria de massa base de tecnologias de imagem. Primárias entre estes são os recursos totalmente quantitativos do método e a sensibilidade adicional da análise devido à resolução de drogas de espécie endógena interferindo/supressão através de separação cromatográfica de LC/MS. No entanto, MALDI-MSI fornece que mais informações espaciais sobre a distribuição de drogas. Como ambos MALDI-MSI e LCM-LC/MS/MS exigem as mesmas etapas de preparação de amostra para gerar seções congeladas do tecido, as duas técnicas podem ser executadas em conjunto na mesma biopsia tecido proporcionando quantificação completa ao lado de imagens altamente detalhadas de droga distribuição. Um exemplo da exigência de maior sensibilidade analítica é mostrado na Figura 3. Apenas níveis muito baixos de sinal EMB foram detectados na região central de granuloma necrótico da imagem MALDI-MS (mostrada na Figura 3B), sugerindo caseum penetração da droga é pobre. No entanto, devido o limite superior de detecção do LCM-LC/MS, a droga foi claramente comprovada que para alcançar concentrações esterilizantes dentro o compartimento e a concentração de fármaco presente era predominantemente indetectável por MALDI (Figura 3A).
Protocolos de coloração de tecidos são normalmente usados antes de LCM para aplicações de proteomic para permitir a fácil identificação de áreas de tecido e as populações de célula localizadas dentro. Rotina histochemical manchas tais como H & E não são compatíveis com a quantificação de drogas, como o solvente muitas etapas de lavagem envolvido seria delocalize a droga da seção do tecido. Seções de corte adjacentes podem ser coradas com H & E e usadas como um guia para microdissection. No entanto, isso não é normalmente necessário, como os compartimentos de lesão podem ser opticamente resolvidos pelo microscópio padrão LCM brightfield (Figura 2).
Otimização das etapas de corte e microdissection é crucial para a quantificação de lesão bem sucedida. Durante o desenvolvimento do método, avaliamos dois materiais diferentes de membrana, polietileno tereftalato (PET) e polietileno naftalato (caneta), como substrato para as secções de tecido para microdissection da montagem. Membranas de caneta sofriam de carregamento estático aumento em comparação com membranas de PET e aproximadamente 30% de todas as áreas de tecido dissecado foram perdidos devido a atração estática entre a região de tecido dissecado e a membrana. Por esta razão, membranas de PET foram escolhidas para dissecções futuras devido a atração estática significativamente reduzida observada (apenas 5% das regiões dissecadas de membranas de PET foram perdidos durante o processo de LCM).
A estabilidade de drogas dentro de seções de tecido é uma consideração importante ao projetar um estudo LCM-LC/MS. Durante o processo de corte e dissecação, as secções de tecido são expostas a luz e a temperatura do laboratório por um período de pelo menos 1 hora. Outras questões a considerar incluem a eficiência de extração da droga de seções do tecido, como não há nenhuma etapa de homogeneização envolvida (extração só é executada pelo vórtice de mistura e sonication). Em nossa experiência, a extração não sofre a falta de homogeneização do tecido devido ao solvente de extração elevada a proporção de tecido usado e a magreza das secções de tecido dissecado. Nossas observações são de acordo com um método de LCM-LC/MS on-line descritas anteriormente desenvolvido para quantificar o propranolol em cortes de tecido microdissected do cérebro e fígado, onde observou-se extração completa de drogas de tecido de 20 µm e espessura de 40 µm seções de10. Nós validado a eficiência de extração de drogas e a estabilidade da droga durante o processo de LCM, comparando diretamente as concentrações de tecido pulmonar (do mesmo coelho e lóbulo do pulmão) analisados por LCM-LC/MS com concentrações determinadas pelo tecido padrão homogeneização e LC/MS (um exemplo é mostrado na tabela 1). Esta comparação nos permite determinar se qualquer mudança de sinal está ocorrendo entre as duas metodologias.
A densidade das regiões de tecido dissecado também é uma consideração importante quando a quantificação dos níveis de drogas baseado na área de superfície de tecido ou volume. Isto é de particular preocupação para biópsias pulmonares e lesões, em que as áreas de tecido sem envolvimento pulmonar têm uma densidade total menor do que celular e caseum (menos tecido que cobre a mesma área de superfície relativa) devido à presença de vários bronquíolos abertos e espaços alveolares. Os efeitos dessa diferença na densidade podem ser atenuados pelo desenho cuidadosamente ao redor de espaços abertos para evitar incluí-los dentro da área de superfície cumulativa do tecido coletado (como mostrado na Figura 2).
Uma limitação adicional é que o método de LCM-LC/MS apresentado apenas quantifica a concentração do fármaco total dentro do tecido isolado (em comum com todos os tecido homogeneização, extração de solvente e abordagens de quantificação de LC/MS) e não resolver concentrações de proteínas droga fracções não acopladas. Microdialysis é uma abordagem alternativa para quantificar desacoplada drogas dentro de tecido e permite a quantificação precisa das concentrações de droga livre atingindo extracelulares populações de bactérias13. No entanto, a técnica seria melhor aplicar como uma abordagem complementar, pois não possui a especificidade espacial do LCM-LC/MS e apenas quantifica níveis de droga solúvel dentro do fluido extracelular do tecido, não o conteúdo intracelular.
Nós combinamos, pela primeira vez, LCM e LC/MS para quantificar espacialmente antibióticos no local da infecção tuberculosa. A metodologia é tremendamente poderosa, uma vez que pode ser aplicado para qualquer droga pequena molécula usada em qualquer estado de doença. Na verdade, nós recentemente têm quantificado um candidato antifúngico em um modelo do rato da candidíase abdominal14. Diferencial droga particionamento em compartimentos de tumor heterogêneo (incluindo núcleos necróticos) é uma preocupação primordial no tratamento de câncer e uma área crítica de pesquisa em câncer de descoberta de drogas15. LCM-LC/MS é idealmente adequada para abordar estas questões. Além disso, LCM-LC/MS pode ser usada para descoberta de biomarker ao quantificar metabólica, lipidomic e proteomic alterações ocorrem em regiões de tecido e populações de células durante a patogênese da doença.

A capacidade de espacialmente resolver e quantificar os níveis de droga é um requisito fundamental para determinar se medicamentos anti-tuberculose alcançar subpopulações bacterianas dentro de lesões pulmonares em concentrações1de esterilização. De particular importância é determinar a penetração de drogas para o núcleo necrótico da lesão (chamado de caseum), que normalmente contém o maior número de bacilos e pode ser mal acessível às drogas devido à ausência de vascularização.
Métodos tradicionais para avaliar a penetração da lesão, que envolvem a homogeneização de lesões pulmonares extirpadas seguido por extração com solventes e análise de espectrometria de massas (LC/MS) cromatografia líquida, são altamente sensíveis e seletiva para as drogas de interesse. No entanto, estes métodos oferecem informação espacial pobre, limitada ao tamanho do original tecido homogeneizado. Espectrometria de massa-baseado imagem abordagens, tais como dessorção laser assistida por matriz (MALDI) de ionização2,3, desorção electrospray ionização (DESI)4 ou extração de superfície líquido-reforçada5, 6 oferecem recursos de imagem altamente espacialmente resolvidos, mas a quantificação directa pode ser extremamente desafiador ou impossível devido a efeitos de supressão de íon heterogêneos e diferentes eficiências de extração do analito da célula de várias ou7tipos de tecido. Além disso, abordagens de imagem mais diretas tecido MS são inerentemente menos sensíveis do que a LC/MS, devido à falta de separação cromatográfica de espécie endógena competindo por ionização e a baixa eficiência de extração com solvente da droga do tecido.
Do laser microdissection de captura (LCM) combinado com análise de LC/MS foi aplicado rotineiramente para isolar e caracterizar regiões distintas de tecido para proteômica estuda8,9 e recentemente utilizada para quantificação de drogas em uma dose tecido animal10. Aqui nós apresentamos um protocolo otimizado aplicando LCM combinado com análise de LC/MS (LCM-LC/MS) para quantificar a fármacos anti-TB dentro de compartimentos distintos granuloma. No processo do laser microdissection captura, um laser UV é focado com o objetivo de microscópio para a seção de tecido, que corta e isola a área de tecido desejado, seguindo um caminho definido pelo usuário. Para gravidade assistida LCM (a técnica utilizada para esta pesquisa), a seção de tecido é montada sobre um slide de membrana fina de polímero (PET ou caneta) e o tecido é capturado em um tampão de tubo coleção situado abaixo do slide. As drogas são extraídas do tecido excisado e quantificados utilizando abordagens padrão de LC/MS. A quantidade de tecido devem ser coletados em última análise, é determinada a concentração desejada do fármaco presente nos tecidos e a sensibilidade do método LC/MS. Para a maioria das análises de drogas dosado em níveis terapêuticos e analisados utilizando um espectrômetro de massa de rotina triplo quadrupolo, 3 milhões µm2 (3 mm2) de tecido, área de superfície é suficiente.
Este protocolo descreve a poderosa combinação de perfis espaciais e quantificação completa oferecido pela LCM-LC/MS, fornecendo a concentração absoluta de drogas dentro de todos os compartimentos de granulomas TB. A técnica também pode ser aplicada para determinar as concentrações de drogas em muitos diferentes tecidos doentes, fornecendo informações de descoberta e desenvolvimento de drogas vitais.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

Tuberculose ainda é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Melhorias aos regimes da droga existentes e o desenvolvimento de novas terapêuticas são urgentemente necessárias. A capacidade das drogas de TB dosadas para alcançar e esterilizar as bactérias dentro mal vascularizado necróticas regiões (caseum) de granulomas pulmonares é crucial para a intervenção terapêutica bem sucedida. Regimes terapêuticos eficazes, portanto, devem conter drogas com propriedades de penetração de caseum favorável. Métodos atuais de LC/MS para quantificação dos níveis da droga em tecidos biológicos têm limitado a capacidades de resolução espacial, tornando difícil determinar com precisão a concentrações de drogas absoluto dentro de compartimentos de tecido pequenas tais como aqueles encontrados dentro granulomas necróticos. Aqui nós apresentamos um protocolo combinando laser captura microdissection (LCM) das regiões de tecidos patologicamente distinta com quantificação de LC/MS. Esta técnica fornece quantificação absoluta de drogas dentro de granuloma caseum, envolvendo a lesão celular e tecido sem envolvimento pulmonar e, portanto, com precisão determina se as concentrações bactericidas estão a ser alcançadas. Para além da investigação da tuberculose, a técnica tem muitas aplicações potenciais para espacialmente resolvidos de quantificação de drogas em tecidos doentes.

Uma visão geral da abordagem LCM-LC/MS é mostrada na Figura 1. Após a esterilização o tecido por irradiação gama, todas as etapas subsequentes (a partir de tecido de corte em diante) ocorrem fora do BSL3 condições. A Figura 2 mostra a lesão seções biópsia antes e após o isolamento do tecido por LCM. Áreas necrosadas e celulares de lesões TB podem ser facilmente identificadas e isoladas por inspeção visual de imagens ópticas sozinhas (sem a necessidade de referir-se a seções manchadas histologicamente tecidos adjacentes). O processo de dissecção produz um corte limpo com o mínimo de perturbação para o tecido circundante, e 3 milhões de dissecação µm2 (3 mm2) de cada região de interesse das lesões leva aproximadamente 1 hora no total.
A eficiência de extração e estabilidade do método LCM-LC/MS foi avaliada usando pulmão Ethambutol EMB-cravado homogeneizado (tabela 1). Extração completa da droga foi observada, e sem problemas de estabilidade de drogas foram detectados através do processo de dissecação e extração. O protocolo de extração e quantificação de LCM-LC/MS mais foi validado pela comparação de métodos de quantificação de LC/MS estabelecidos aplicados aos tecidos mesmos. Devido a heterogeneidade inerente de lesões necróticas de TB pulmonares e a especificidade espacial pobre oferecido pela homogeneização do tecido padrão, nós o método LCM-LC/MS validado comparando diretamente as concentrações da droga no pulmão sem envolvimento analisados por ambos os técnicas analíticas (devido à sua homogeneidade do tecido relativamente alto). A tabela 2 mostra as concentrações da droga no pulmão sem envolvimento de biópsias de três coelhos Ethambutol-dosado conforme avaliado por: 1) homogeneização de 25 µm de seções de tecido grosso e analisar por LC/MS padrão e análise de 2) LCM-LC/MS sem envolvimento pulmonar áreas de tirado de uma secção de tecido grosso adjacente 25 µm. Os dados mostram que duas abordagens produzem dados consistentes de quantificação, demonstrando a adequação para quantificação espacial de rotina.
Nós aplicamos LCM-LC/MS para espacialmente-quantificar muitos existentes e novos fármacos anti-TB dentro de lesões pulmonares. A figura 3A mostra dados de exemplo de coelhos infectados por MTB dosado estado estacionário com Etambutol. LCM-LC/MS habilitado completa quantificação do fármaco resolvido dentro de caseum, lesão celular e áreas de tecido sem envolvimento pulmonar. EMB foi observada para penetrar bem a lesão e alcançar concentrações esterilizantes dentro o caseum necrótico. A correspondente imagem MALDI-MS de distribuição EMB adquirida de uma secção de tecido adjacente é mostrada na Figura 3B. As imagens de MALDI-MS qualitativas correlaciona-se bem com os dados quantitativos de LCM-LC/MS com concentrações de droga detectadas no caseum necrótico em comparação com a borda celular. LCM-LC/MS dados foi validados por comparação directa ao tecido homogenates analisado por LC/MS padrão.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57402/57402fig1.jpg"> Figura 1 : Esquemática do processo de LCM-LC/MS. Biópsias de pulmão coelho contendo lesão necrótica junto com ao redor sem envolvimento pulmonar são coletadas e congeladas. Cryosections são cortadas em finas membranas de PET e áreas de lesão celular e caseosa de sem envolvimento pulmonar, são dissecadas e isoladas para quantificação por LC/MS. adaptado de Zimmerman et al 12 <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57402/57402fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57402/57402fig2.jpg"> Figura 2 : Lesão (A, B) e sem envolvimento pulmonar (C, D) como eles aparecem quando exibido usando o microscópio antes (A, C) e depois (B, D) microdissection. Áreas de lesão caseosa aparecem mais escuros e 'rachado' no scan imagem óptica (um, contorno verde). Lesão celular é de cor mais clara e mais sólida na estrutura (A, contorno vermelho). Sem envolvimento pulmonar deve ser amostrado pelo menos 5 mm de distância da fronteira da lesão e aparece vermelho/rosa na cor (C, contorno ciano). Escala de barras (preto, azul e roxo) = 400 µm. Note que apenas sólidas áreas do pulmão não envolvido devem ser seleccionadas para evitar incluindo espaços alveolares e bronquíolos na superfície total do tecido coletado (conforme mostrado em D). <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57402/57402fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57402/57402fig3.jpg"> Figura 3 : Conjunto de dados de exemplo LCM-LC/MS de biópsias de lesão de dois coelhos, uma dose de 100 mg/kg EMB durante 7 dias. (A) favorável penetração da droga em todos os compartimentos do pulmão e a lesão foi observada. Concentrações de drogas quantificadas por LCM-LC/MS (barras ocas) /MS foram forte de acordo com aqueles quantificada de lesões dissecadas homogeneizadas por LC/MS padrão (barras de sólido, média ± desvio padrão, n = 3-8). A concentração mínima necessária para matar 99% dos bacilos replicação extracelulares (MBC99) e 99% dos bacilos intracelulares nos macrófagos (iMBC99) é indicada. Painel superior (B) : imagem MALDI-MS, mostrando a distribuição de EMB íon [M + H]+ (m/z 205.193) dentro de uma secção de tecido adjacente. Observe que a imagem MALDI-MS sugere pobre penetração do EMB para o caseum devido as concentrações de drogas presente sendo o limite inferior de detecção (LOD) da técnica. No entanto, a especificidade espacial e superior LOD de LCM-LC/MS mostram que a droga está atingindo concentrações esterilizantes dentro de todos os compartimentos de lesão, incluindo o caseum. Painel inferior: hematoxilina & eosina manchado seção tecido diretamente adjacente à seção usada para MALDI MSI. Estavam presentes no tecido Cellular (C) e granulomas necróticos (NG). O núcleo de caseum é descrito em branco. Adaptado de Zimmerman et al 12 <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57402/57402fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dissecado área (µm2)</td>
			<td>Medido EMB HCl (ng/g) (n = 3)</td>
			<td>Recuperação EMB (%) (n = 3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 milhões</td>
			<td>10633 (±404)</td>
			<td>106 (± 4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 milhões</td>
			<td>10057 (±1132)</td>
			<td>101 (±11)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 milhões</td>
			<td>10563 (±1128)</td>
			<td>105 (±11)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Eficiência de extração do método para quantificar EMB no pulmão LC-LC/MS. Recuperação completa do EMB observou-se nos tecidos EMB cravado pulmão homogenate dissecado para todos os volumes de tecido avaliado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID de coelho</td>
			<td>LC/MS EMB (ng/g)</td>
			<td>LCM-LC/MS EMB (ng/g)</td>
			<td>Diferença (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>899</td>
			<td>2910</td>
			<td>3320</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>904</td>
			<td>2010</td>
			<td>1870</td>
			<td>-7</td>
		</tr>
<tr>
<td>911</td>
			<td>2150</td>
			<td>2370</td>
			<td>9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Comparação de EMB quantificação em biópsias de pulmão sem envolvimento de 3 coelhos dosados por LC/MS e LCM-LC/MS. Concentrações de droga equivalente foram detectadas por métodos e sem perda de sinal devido à degradação ou extração durante o processo de LCM-LC/MS foi observada.

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K visualizações.  Rutgers, The State University of New Jersey. Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Imunologia e Infecção

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Bioquímica

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Medicina

Acelerando a determinação da tuberculose usando o método de micro-UFC

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autor em destaque: Otimizando a determinação de UFC para avaliação eficiente da eficácia da vacina contra TB e análise de apresentação de antígeno 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Preparação de amostras de

Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em

A

Análise de ¹⁸FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose