Name: a behavioral assay for investigating the role of spatial memory during instinctive defense in mice
Uploaded: 2018-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por um Wellcome Trust/real sociedade Henry Dale Fellowship (098400/Z/Z/12), um Conselho de pesquisa médica (MRC) conceder MC-UP-1201/1, Wellcome Trust e Gatsby Charitable Foundation SWC Fellowship (para tuberculose), MRC PhD Studentship (D.E. e RV) e uma bolsa de doutoramento de Fonds Boehringer Ingelheim (para RV). Agradecemos a Kostas Betsios para o software de aquisição de dados, o LMB mecânicos e elétricos oficinas para construção da arena experimental de programação.

Todos os experimentos foram realizados sob o ato de UK animais (procedimentos científicos) de 1986 (70/7652 PPL) após a aprovação ética local.
1. criação de aparato comportamental
Nota: O principal componente do aparato comportamental é uma variante da Barnes labirinto13 consiste em uma plataforma circular acrílica (92 cm de diâmetro) branca com 20 equidistantes, 5 cm de diâmetro, orifícios circulares, localizado radialmente, 5 cm da borda da plataforma . 19 delas são para ser fechada com tampa de plástico preta (5 mm de profundidade), enquanto o restante buraco leva a um abrigo de Perspex preto (dimensões 15 x 5,8 x 4,7 cm) que os ratos podem facilmente entrar e sair. A área central da arena consiste em uma plataforma circular fixa (22 cm de diâmetro) e a periferia é montada sobre um quadro que permite mais de 360 graus de rotação através de um motor de passo controlado por computador. A plataforma é elevada a 45 cm do chão para evitar que os ratos descer. Veja o desenho esquemático na Figura 1.
<ol><li>Anexar sugestões de visual para a periferia da plataforma (2D ou 3D símbolos com diferentes formas, cores e padrões), pelo menos a 2 cm da borda para evitar ratos de alcançá-los. Nota: Exemplos de indicações visuais são simples quadrados azuis de 262 cm2ou círculos (diâmetro de 15,5 cm) cheios de listras diagonais de roxas.</li>
	<li>Adicione ~ 2 g do fundamento da gaiola do rato de casa no interior do abrigo para servir como uma sugestão de local olfativa. Opcionalmente, posicione uma luz emitida por diodo (LED) na entrada do abrigo para fornecer uma indicação de marco visual local.</li>
	<li>Para isolar o mouse externo, indicações visuais distais, montar uma parede cilíndrica ou octogonal, estendendo-se 40 cm acima e 15 cm abaixo da superfície da plataforma, em torno da arena, posicionada a 10 cm de distância da borda da plataforma.</li>
	<li>Posicione um altofalante de ultra-som 50 cm acima do centro da plataforma, para fornecer estímulos auditivos aversive.</li>
	<li>Coloque uma tela translúcida 64 cm acima da arena para trás-projeto sobrecarga aversive estímulos visuais usando um projetor.</li>
	<li>O fornecido pelo projector acenderá o aparato comportamental; calibrá-lo para que haja 5-10 lx no centro da superfície da plataforma. Coloque luzes infra-vermelhas e uma câmera infravermelha acima da plataforma, com um filtro de passa-tempo (> 700 nm) para evitar tremulação de projetor no vídeo adquirido.</li>
	<li>Controle a posição do mouse on-line, usando um algoritmo apropriado ou software disponível comercialmente. Para controlar os ratos pretos em uma arena de branca, uma operação simples de limiarização seguida pelo cálculo do centroide da máscara é apropriada.</li>
	<li>Idealmente, coloque o aparelho comportamental dentro de uma caixa de som - e à prova de luz, para evitar que sinais externos que afetam a experiência.</li>
</ol>2. fornecimento de estímulos intrinsecamente contrário
Nota: Os estímulos descritos abaixo podem ser gerados com uma vasta gama de pacotes de software diferentes, incluindo o LabVIEW e Matlab.
<ol><li>Estímulo visual<ol>
<li>Projeto dos estímulos para a tela posicionado 64 cm acima da arena. O estímulo é composto por um círculo escuro linearmente em expansão em um fundo cinza22 (contraste Weber =-0.98, luminância = 7,95 cd/m2). Nota: O círculo padrão idealmente deve ser centralizado diretamente acima da posição do mouse, subtending num ângulo visual de 2,6 ° pelo aparecimento e expande-se linearmente em 224 ° /s mais de 200 ms para 47,4 °, no qual permanece por 250 ms antes de deslocamento.</li>
		<li>Quando entregar o estímulo visual, centralizá-la acima do mouse. Isto pode ser conseguido esperando até que o mouse passa por uma região previamente definida na arena, ou rastreamento da posição do mouse on-line e usando as coordenadas de localização para definir o centro do círculo. Nota: Embora sugerimos projetando o estímulo visual diretamente acima do rato, comportamentos defensivos podem também ser provocados se projeta-se o mesmo estímulo à frente o mouse (enquanto ainda paralela ao chão). Em nossa experiência, este é o caso, pelo menos até 30 cm à frente da posição do mouse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estímulo auditivo<ol>
<li>Desencadear um estímulo que consiste de um comboio de três frequência modulada acima-varreduras de 17 a 20 kHz23 mais de 3 s, durando 9 s no total. O nível de pressão sonora (SPL), medido no nível da plataforma, deve ser em um intervalo entre 73 e 78 dB.</li>
		<li>Ligar uma placa de som e um amplificador ao altifalante ultra-som posicionado acima da arena para entregar o estímulo auditivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. animais:
<ol><li>Use Camundongos C57BL/6J masculinos ou femininos, entre 6 e 24 semanas de idade. Manter que os animais em uma luz h 12 ciclo com livre acesso a comida e água.</li>
	<li>Certifique-se de que os ratos são único abrigado pelo menos 72 h antes do ensaio comportamental e teste-os durante a fase de luz da luz do ciclo. Nota: Nós achamos que o comportamento exploratório de base dos ratos alojados em single é mais comparável em animais do que em ratos alojados em grupo. Além disso, animais com implantes cirúrgicos para gravação de atividade neural ou manipulação frequentemente precisam ser único abrigado, e, portanto, pode ser benéfico ter conjuntos de dados do controle nas mesmas condições de habitação.</li>
</ol>4. padrão ensaio comportamental:
<ol><li>Meticulosamente, limpe a superfície da plataforma com 70% de etanol ou ácido acético para remover indesejadas sugestões olfactory. Lave o abrigo com água e lave-o com etanol a 70%, após o qual ele deve ser lavado com água novamente para diminuir o odor de etanol.</li>
	<li>Seque bem tanto a plataforma e o abrigo, como o mouse pode evitar entrar no abrigo se está molhado.</li>
	<li>Randomize a localização do abrigo na plataforma para cada julgamento, rodando a plataforma antes do experimento. O local de abrigo será ancorado na arena, mas será rotacionado em relação ao compartimento do aparato comportamental.</li>
	<li>Trazer o rato para a sala de experiências em sua casa-gaiola e coloque a gaiola em cima da plataforma do teste por um período de aclimatação de 10 min.</li>
	<li>Remover o rato de sua casa-gaiola e evitar recuperando pela cauda: Copa-lo ou deixá-lo subir um item de enriquecimento que pode ser levantado. Pegar ratos pela cauda foi mostrar para aumentar os níveis de ansiedade e assim pode afetar as respostas comportamentais para ameaça24.</li>
	<li>Delicadamente, coloque o mouse no centro da arena e começar a aquisição de vídeo.</li>
	<li>Permita, por um período de habituação de 7 min, durante o qual nenhum estímulo contrário é apresentado. Certifique-se de que o mouse tem tempo suficiente para encontrar e entrar no abrigo pelo menos uma vez. Considerá-la como uma entrada se todos os quatro membros estão dentro do abrigo. 7 min deve ser suficiente para a maioria dos ratos encontrar e entrar no abrigo, mas caso isso não aconteça, prorrogar o período de habituação por períodos adicionais de 5 min até que tenha verificada pelo menos uma entrada.</li>
	<li>Acionar a entrega do estímulo contrário (auditivo ou visual) ou manualmente, observando o feed de vídeo ao vivo, ou automaticamente pelo rastreamento da posição do animal on-line e pré-definir uma região de interesse na arena para desencadear o estímulo-entrega uma vez que o animal chega-lo. O estímulo visual é normalmente entregue diretamente acima do animal usando o vídeo on-line rastreamento coordenadas.</li>
	<li>Para obter mais do que uma reação de fuga na mesma sessão, deixe o mouse abandonar voluntariamente o abrigo. Se o mouse não escapou com êxito para o abrigo após o último estímulo contrário, espere pelo menos 60 s antes de apresentar outro estímulo.</li>
	<li>Depois que terminar o ensaio, devolver o animal para sua casa-gaiola. No caso, são necessários mais ensaios do mouse mesmo, espere pelo menos 48 h antes de refazer o teste.</li>
	<li>Limpe a plataforma e o abrigo, conforme descrito na etapa 4.1 e 4.2 antes de testar o próximo animal.</li>
</ol>Nota: As etapas 5, 6 e 7 são variações independentes do ensaio padrão comportamental e cada um pode ser realizado individualmente.
5. «estratégia de navegação» ensaio comportamental:
Nota: O objetivo deste teste é determinar que cues mouses usam para orientar o comportamento de fuga. Neste ensaio, a parte externa móvel da plataforma é girada, enquanto o mouse está no centro da arena fixa, que desloca radialmente o abrigo, as sugestões olfactory, localizadas no interior do abrigo e indicações visuais proximais anexadas à plataforma. Se o mouse está seguindo qualquer uma das dicas que têm sido giradas para navegar para o abrigo, ele escapará corretamente para o novo local do abrigo, mas se ele usa quaisquer outras sugestões que permaneceram no lugar, navegará até o local de abrigo anterior.
<ol><li>Execute as etapas 4.1 a 4.8 do padrão ensaio comportamental descrito acima, provocando pelo menos uma resposta de voo para ser usado como linha de base.</li>
	<li>Deixe o mouse ativamente sair do abrigo e esperar por ele para navegar até a parte central da plataforma. Coloque um pequeno prato com fundamento no centro para incentivar a exploração e manter o animal na plataforma central suficientemente longo para permitir a rotação da parte externa da plataforma. Adicione o prato e roupa de cama enquanto o mouse está dentro do abrigo e após a fuga bem sucedida, que precede a rotação da plataforma. Se o rato não entrar o abrigo durante a resposta de fuga, espere por ele para entrar voluntariamente o abrigo e em seguida, adicione o prato e roupa de cama.</li>
	<li>Use o motor de passo para girar a plataforma pelo menos 36 graus (2 furos) e imediatamente use um estímulo sensorial para eliciar uma resposta de fuga. É possível que a rotação aciona um alarme e nem inicia uma resposta de fuga. Nota: A partir de nossa experiência, ~ 55% dos ratos será executado fora da plataforma central (sem rotação) enquanto a parte externa ainda está a rodar, e estes ensaios devem ser excluídos da análise.</li>
	<li>Limpe a plataforma e abrigo e retornar o mouse para sua casa-gaiola, conforme descrito na etapa 4.10 e 4.11.</li>
</ol>6. «ambiente dinâmico' ensaio comportamental:
Nota: Este ensaio destina-se para avaliar como os ratos se adaptar seus comportamentos defensivos para mudanças súbitas no ambiente. Nesses experimentos, após obter resposta de pelo menos uma fuga, o local do abrigo é alterado e o mouse está autorizado a visitá-lo uma vez antes de uma fuga subsequente resposta é disparada. Se o mouse perfeitamente atualiza a nova localização do abrigo e calcula a ausência de abrigo no seu local anterior, ela deve escapar para o novo local. Caso contrário, ou não memorizou o novo local do abrigo ou ele memorizou os dois locais, mas prefere fugir para o outro.
<ol><li>Execute este ensaio depois passos 4.1 a 4.8 descrito acima, provocando pelo menos uma resposta de voo como um controle.</li>
	<li>Uma vez que o mouse voluntariamente sai do abrigo, remover o abrigo e coloque-o novamente em um novo buraco no extremo oposto da plataforma.</li>
	<li>Permitir que o mouse para explorar o ambiente até que entra o abrigo na sua nova localização.</li>
	<li>Quando o mouse sai do abrigo, presente com um estímulo contrário voluntariamente e observar sua resposta.</li>
	<li>Use o estímulo auditivo para este experimento por causa de sua longa duração, como sob a ameaça prolongada, animais podem executar respostas adicionais fuga para outros locais se eles não conseguem encontrar o abrigo em primeiro lugar.</li>
	<li>Limpe a plataforma e abrigo e retornar o mouse para sua casa-gaiola, conforme descrito nas etapas 4.10 e 4.11.</li>
</ol>7. «sem abrigo» ensaio comportamental:
Nota: O objectivo deste teste é entender como a ausência de um abrigo no ambiente afeta a expressão de comportamentos defensivos.
<ol><li>Conecte todos os 20 buracos. Neste experimento, há nenhum abrigo disponível na arena.</li>
	<li>Após a limpeza e secagem da plataforma (etapas 4.1 e 4.2), realizar etapas 4.4-4.6.</li>
	<li>Permita um período de habituação de 7 min.</li>
	<li>Apresentar o estímulo visual e observar a resposta defensiva. A falta de um abrigo promove o comportamento congelar, dura geralmente para a duração do estímulo visual. Use um ponto lentamente em expansão (ex. um círculo que subtende um ângulo visual de 2,6 ° pelo aparecimento e expande-se linearmente em 11,2 ° /s sobre 4 s para 47,4 °, no qual permanece por 1 s antes de deslocamento) para facilitar a observação de congelação respostas.</li>
	<li>Se mais de uma resposta por rato for necessária, use um estímulo inter intervalo pelo menos 60 s.</li>
	<li>Depois de obter o número necessário de respostas na ausência do abrigo, introduzir o abrigo sob um dos furos e deixe o mouse explorar o ambiente pelo menos 5 min. 5 min será tempo suficiente para a maioria dos ratos localizar e inserir o abrigo recém-introduzidos , mas caso isso não aconteça, alargar este período adicional 5 min blocos até pelo menos uma entrada é verificada.</li>
	<li>Repita as etapas de 4.8 e 4.9 e observar as respostas de fuga realizadas na presença de um abrigo no ambiente.</li>
	<li>Limpe a plataforma e abrigo e retornar o mouse para sua casa-gaiola, conforme descrito nas etapas 4.10 e 4.11.</li>
</ol>8. os dados análise:
Nota: Cada uma das etapas de análise de dados a seguir pode ser executada independentemente.
<ol><li>Respostas de fuga podem ser facilmente identificadas como uma aceleração súbita após a apresentação de um estímulo contrário. Quantificar a latência de fuga como o tempo entre a apresentação do estímulo e o início de um movimento de rotação de cabeça direcionado para o alvo da fuga ou o início do movimento de aceleração, o que vier primeiro.</li>
	<li>Congelamento de respostas pode ser caracterizado por total imobilidade do animal exceto respirando movimentos25, duradoura, pelo menos 0,5 s7. Medi a latência para congelar como o tempo entre a apresentação do estímulo contrário e o início do período de imobilidade.</li>
	<li>Para cada resposta de fuga, quantificar a linearidade da trajectória de voo calculando a razão entre a distância entre o rato e o abrigo e o deslocamento real durante o voo.</li>
	<li>Para cada resposta de fuga, calcule a precisão, medindo a distância entre onde o animal dirigido seu voo para o buraco e o buraco, levando para o abrigo. Uma vez que existem 20 furos, cada buraco fora do alvo representa um decréscimo de 10% na exatidão (ex., 2 furos fora do alvo podem ser expressa como 80% de precisão)</li>
	<li>Para o ensaio comportamental 'estratégia de navegação', quantificar a exatidão da resposta em relação ao local de abrigo antes da rotação da plataforma. Uma precisão média que não é significativamente diferente da precisão da pre-rotação indica que o animal não esteja utilizando qualquer uma das indicações sensoriais que foram giradas para navegar para o destino de fuga.</li>
	<li>Para o ensaio de 'ambiente dinâmico' comportamental, classifica cada resposta de fuga suscitou como sendo dirigido para o novo ou o antigo local de abrigo, ou para nenhum deles. Avalie como o padrão evolui ao longo as iterações dos comportamentos defensivos eliciadas.</li>
	<li>Para o ensaio comportamental 'sem abrigo', comparar a velocidade do mouse, após a apresentação do estímulo visual contrário na presença e na ausência de um abrigo e calcular a latência para o início da resposta defensiva. Além disso, calcule a probabilidade de desencadear uma resposta de congelamento em resposta ao estímulo para cada situação.</li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DBA/2+and+C57BL/6+mice+differ+in+contextual+fear+but+not+auditory+fear+conditioning.">DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning.</a> Behavioral neuroscience. 108 (4), 810 (1994).</li><li>Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+memory:+Theoretical+basis+and+comparative+review+on+experimental+methods+in+rodents.">Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents.</a> Behav Brain Res. 203 (2), 151-164 (2009).</li></ol>

A maioria dos dados incluídos na seção de resultados é um subconjunto dos dados apresentados no Vale et. al 2017.

Os ensaios que descrevemos aqui são tecnicamente simples de executar, e com excepção da plataforma experimentos de rotação, pode ser implementado facilmente em um labirinto de Barnes padrão. No entanto, algumas complicações podem surgir: por um lado, o rato pode parecer com medo de entrar no abrigo, que pode ser devido ao abrigo de não ser suficientemente limpos ou secas. Por outro lado, o mouse pode ficar dentro do abrigo por longos períodos de tempo. É crítico para estas experiências que os animais são nunca removidos do abrigo manualmente, como isso pode perturbar a integração do caminho, bem como a angústia dos animais e mudar sua resposta à ameaça. Sugerimos que encerra o experimento após 90 min e refazer o teste após 48 h se necessário. Uma outra consideração prática relevante é que quando o mouse investiga a borda da plataforma, não pode detectar estímulos visuais se sua cabeça é dobrada sobre a borda, e, portanto, é recomendável reter os estímulos em tais situações. Além disso, os ratos podem saltar fora da plataforma em raras ocasiões. Sugerimos que terminando o experimento e refazer o teste após 48 h. ratos que ativamente deixar a plataforma uma vez poderão fazê-lo novamente no futuro e podem ter que ser excluídos do estudo. Finalmente, de nossa experiência, a maioria dos ratos responderá ao estímulo visual (34/36 ratos). No entanto, se os ratos não mostram qualquer tipo de resposta ao estímulo visual (um alarme, um voo ou uma resposta de congelamento), eles devem ser excluídos do estudo.
Um aspecto importante a considerar é que o controle de sinais sensoriais normalmente é um problema em ensaios de memória espacial, como muitas vezes é difícil de eliminar todas as possíveis fontes de contaminação pistas. Nossa configuração experimental reduz visuais externas, em torno do labirinto com uma parede, e é colocado dentro de um armário de amortecimento-som para isolamento acústico. Para minimizar as sugestões olfactory, recomendamos limpar cuidadosamente a afinação com 70% de etanol ou ácido acético entre experiências.
Nosso ensaio comportamental adiciona métodos anteriores para estudar navegação espacial26 usando comportamentos defensivos instintivos para sondar a memória espacial e com foco em cenários etológicos. Uma diferença fundamental entre os procedimentos descritos aqui e o teste padrão do BM é a falta de sessões de treinamento. Em nossos ensaios, o período de habituação garante que o mouse visita o abrigo pelo menos uma vez e, frequentemente, muitas vezes mais, que temos demonstrado anteriormente para ser suficientes para memorizar o abrigo local2. Acreditamos que uma razão importante para a elevada taxa de sucesso e precisão em encontrar o abrigo apesar da falta de treinamento nunca passivamente é deslocar o animal durante o experimento, tornando assim a integração do caminho uma estratégia viável de navegação. No entanto notamos que nosso ensaio lida com memória formada e avaliados durante uma única sessão, e que nós não testamos para memória de longo prazo da localização do abrigo, que geralmente é o objetivo do padrão BM experiências. Finalmente, usando estímulos intrinsecamente contrário discretos ao invés do fã comumente usado ou buzz para a duração da sessão, nosso ensaio fornece controle experimental muito bom em dois comportamentos que podem usar estratégias diferentes de navegação: forrageamento e fuga de abrigo-dirigido. Acreditamos que o uso destes ensaios em combinação com técnicas da moderna neurociência para gravação e manipulação de atividade neural pode fornecer insights importantes sobre circuitos neurais como calcular o comportamento.

Comportamentos defensivos instintivos são amplamente considerados hardwired-respostas aos estímulos, tais como o movimento de C-início em peixes e anfíbios, que move o animal longe de uma fonte de ameaça1. No entanto, comportamentos defensivos podem ser mais adaptáveis se flexìvel levam em conta as informações sobre o ambiente atual. Um exemplo de tal flexibilidade é o interruptor de fuga para congelamento mostrado por roedores quando confrontado com a ameaça, dependendo do conhecimento prévio sobre a presença ou ausência de um abrigo no ambiente2,3. Outros exemplos de flexibilidade em comportamentos inatas incluem adapta o limiar de início de voo ou escapar de velocidade dependendo da distância entre uma presa e seu abrigo4, distância anteriores e a ameaça de5,6, experiência 11 , 12, bem como selecionando diferentes estratégias defensivas, dependendo das propriedades sensoriais do estímulo aversive7, ou mesmo suprimir o comportamento defensivo face a concorrentes motivações como fome8, 9,10. A dependência de seleção de ação no conhecimento adquirido sobre as características espaciais do ambiente faz instintivos comportamentos defensivos em camundongos um poderoso modelo para o estudo objetivo seleção, memória espacial e navegação. Aqui, descrevemos a adaptação de uma tarefa comportamental comumente usada, a memória espacial de labirinto (BM) de Barnes do ensaio13, para determinar a influência do ambiente espacial na seleção de ação defensiva em ratos e suas estratégias de navegação quando fugindo em direção um abrigo.
O labirinto de Barnes padrão usado para estudar a memória espacial e aprendizagem em ratos consiste em uma plataforma de diâmetro circular ~ 90 cm com 20 furos igualmente espaçados, dos quais 19 estão fechadas, e um leva a um abrigo subterrâneo que ratos procuram a fim de evitar o campo aberto ambiente da plataforma. Estímulos aversive fracos (campainha, luz brilhante, ventilador) são frequentemente usados continuamente durante todo o ensaio para tornar o ambiente contrário e assim promover a entrada para o abrigo de14. No ensaio mais comumente usados15,16, o animal tem um julgamento de habituação onde pauta-se para o abrigo manualmente pelo experimentador imediatamente após ser posicionado na plataforma. Isto é seguido por um período de aquisição de 4 dias, onde cada dia que o mouse é permitido navegar livremente no labirinto por 3 min, após o qual novamente manualmente pauta-se para o abrigo se não alcançar, durante o período de exploração. A última fase do ensaio é uma sonda de julgamento sobre o 5º dia (embora uma memória a longo prazo de sete dias julgamento é também comumente realizada) quando o animal explora o labirinto com todos os buracos fechados. Aprendizagem e a longo prazo de memória são quantificados pelo tempo gasto para encontrar o abrigo e pokes nos buracos errados durante o período de aquisição e quando passei perto do furo de abrigo fechado no julgamento de sonda. Resultados típicos mostram uma diminuição do número de erros e latência para alcançar o abrigo durante a aquisição e uma proporção acima-oportunidade de tempo gasto no quadrante contendo o buraco fechado alvo da sonda experimental15.
Enquanto diversas variantes do ensaio BM têm sido descritas anteriormente17,18,19, o paradigma que descrevemos aqui tem três mudanças fundamentais de ensaio padrão. Primeiro, o animal é deixado para explorar o labirinto e encontrar o abrigo por conta própria, e teste é feito na mesma sessão, logo após o abrigo foi encontrado, durante os períodos onde o animal está envolvido em comportamento exploratório. Embora essa configuração não testar a memória de longo prazo, do local de abrigo, ele é projetado para ser um cenário naturalista que imita a exploração do novo território, sob a ameaça de predação. Além disso, permite testes de como animais se adaptar às mudanças agudas no ambiente, tais como mudanças bruscas na paisagem. Em segundo lugar, um aspecto fundamental do nosso ensaio é que o experimentador nunca força o animal dentro ou fora do abrigo, que pode desorientar o animal e excluir caminho integração20 como uma estratégia de navegação viável21. Integração do caminho é uma estratégia de navegação que utiliza sinais de auto-movimento, como pistas proprioceptivas e vestibulares, decorrentes da integração da saída do motor, para atualizar a posição atual do animal e navegar para um objetivo, que não é possível se o animal é deslocado passivamente pelo experimentador. Em terceiro lugar, usamos intrinsecamente contrário visual22 e estímulos auditivos23 para eliciar a fuga para o abrigo, que é facilmente distinguido do comportamento de forrageamento em curso e permite a avaliação e quantificação das estratégias específicas de navegação usado durante a defesa de ameaças iminentes. Propomos que este ensaio será útil para dissecar o papel da memória espacial na seleção e implementação de comportamentos defensivos, e mais geralmente para o mais amplo estudo de navegação objetivo-dirigido e a curto prazo memória espacial. Os protocolos descritos aqui foram introduzidos por Vale et al. em 2017, a que nos referimos aos leitores para mais na discussão de profundidade sobre a justificativa para as experiências e resultados.

<table><tbody><tr><td>Infrared iluminators TV6700</td><td>Abus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DLP projector Infocus IN3126</td><td>Infocus</td><td>0001740992-00000001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound speaker Pettersson L60</td><td>Pettersson Elektronik</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier QTX PRO240</td><td>QTX</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Soundcard Xonar D2</td><td>Asus</td><td>90-YAA021-1UAN00Z</td><td></td></tr><tr><td>HP Z840 desktop</td><td>HP</td><td>F5G73AV</td><td></td></tr><tr><td>100 micron drafting film</td><td>Xerox</td><td>3R98145</td><td></td></tr><tr><td>Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR</td><td>Basler</td><td>106202</td><td></td></tr><tr><td>National Instruments BNC-2110</td><td>National instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 2015 64-bit</td><td>National instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Custom made Barnes maze</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

a behavioral assay for investigating the role of spatial memory during instinctive defense in mice

Evolução selecionou um repertório de comportamentos defensivos que são essenciais para a sobrevivência em todas as espécies animais. Esses comportamentos são muitas vezes ações estereotipadas que suscitou em resposta a estímulos sensoriais intrinsecamente contrário, mas seu sucesso requer flexibilidade suficiente para adaptar a diferentes ambientes espaciais, que podem mudar rapidamente. Aqui, descrevemos um ensaio comportamental para avaliar a influência do conhecimento espacial em comportamentos defensivos em camundongos. Adaptámos o ensaio de memória espacial de labirinto Barnes amplamente usado para investigar como os ratos navegam para um abrigo durante respostas de fuga aos estímulos sensoriais intrinsecamente contrário em um ambiente de romance, e como eles se adaptam às mudanças agudas no ambiente. Este novo ensaio é uma paradigma Etológica que não requer treinamento e explora os padrões de exploração natural e estratégias de navegação em camundongos. Propomos que o conjunto de protocolos descritos aqui são um meio poderoso de estudo dos comportamentos objetivo direcionado e acionadas por estímulo de navegação, que deve ser de interesse para ambos os campos de comportamentos instintivos e memória espacial.

Os ratos expostos a estímulos auditivos ou visuais iniciaram respostas de fuga rápida com latências curtas entre o início da estimulação e o início do voo. A latência média de escapar o estímulo visual foi 202 ± 16 ms (n = 51 respostas de 26 animais) e significativamente mais para estimulação auditiva: 510 ± 61 ms (n = 36 respostas de 15 animais, p< 0,0001 teste t entre visual e auditivo estimulação; Figura 2A) (passo 8.1). Respostas de fuga foram direcionadas com precisão para o abrigo (quer dizer precisão para estímulo visual: 97,2 ± 1,4% e 95,0 ± 1,4% para estímulo auditivo, não significativamente diferente entre os dois tipos de estímulos, p = 0.1655 t-teste; Figura 2B) (etapa 8,4), e as trajetórias de voo estavam perto de uma linha reta (proporção média de deslocamento com distância-abrigo para estímulo visual 107,3 ± 1,3% e 113.9 ± 1,5% para estímulo auditivo; A Figura 2) (passo 8.3). Observando uma curta latência do estímulo é importante distinguir evocada por estímulo do comportamento de homing executa, e a alta linearidade da trajetória do voo demonstra que a resposta de fuga tem o objetivo de alcançar o abrigo e não simplesmente se afastando desde o estímulo.
Apresentação de estímulo após a rotação da parte externa do labirinto enquanto o rato estava parado na plataforma central (intervalo = média de 36° - 90°, 56°) com êxito suscitou respostas de fuga (passo 5). Todos os ratos fugiram para o local anterior do abrigo, sem diminuição na precisão ou linearidade da trajetória de voo em comparação com os ensaios antes de rotação. A precisão média, medida em referência a posição original do abrigo, foi 96,3 ± 1,3% antes da rotação (n = 25 respostas de 8 ratos) e até mesmo um pouco maior após a rotação (100 ± 0%, p = 0,009 teste t entre pré e pós a rotação). A linearidade média em relação a localização original do abrigo foi 109.4 ± 5,0% pre-rotação (25 respostas de 8 ratos) e 109,1 ± 2,1%, pós-rotação (n = 8 respostas dos 8 ratos), p = 0.957 t-teste entre pré e pós-rotação, Figura 3A e B). Estes resultados demonstram que proximal visuais não são utilizados para orientar o voo para o abrigo (passos 8.3-8.5).
Mudar a localização do abrigo, depois de suscitar uma resposta de fuga bem sucedida (etapa 6) resultou em ratos a visitar o novo local de abrigo logo após a mudança (tempo médio para visitar o novo abrigo = 33,1 s, gama = s 4-82). Nos processos sequenciais de estimulação sonora produziram um aumento gradual da probabilidade de escapar para o novo local (44,4% no primeiro julgamento), atingindo 100% em todos os animais pelo quinto julgamento (n = 9 animais, Figura 3). Estes experimentos sonda a dinâmica de atualização da memória de local de abrigo para se adaptar às mudanças no ambiente (etapa 8,6).
Após um período de aclimatação de 7 min para o labirinto com sem abrigo (passo 7), a apresentação de um estímulo de tempo visual s 5 produzido comportamento congelar, ao invés de fuga (congelamento probabilidade = 95,2%, média de tempo de congelamento = 7,9 ± 2,7 s, n = 7 animais). Introdução posterior de um abrigo na mesma sessão e a apresentação do estímulo visual tempo suscitou escapar respostas confiável, mostrando que os ratos com flexibilidade podem trocar estratégias defensivas, dependendo da presença de refúgio (Figura 3D) ( etapas 8.1 e 8.7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56988/56988fig1.jpg"> Figura 1: esquemático da arena comportamental. Desenho dos componentes principais da arena comportamental, visto de cima (à direita) e do lado (à esquerda). Uma grande fração da plataforma pode ser girada, incluindo o abrigo e indicações visuais anexadas. Olheiras na vista top são os buracos que o abrigo pode ser anexado a, que são todos idênticos (um exemplo de local de abrigo é indicado). A arena inteira está contida em um gabinete de amortecimento de som. <a href="/files/ftp_upload/56988/56988fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56988/56988fig2.jpg"> Figura 2: respostas de fuga são rápidos e precisos comportamentos meta-direcionado. (A) a latência para o início da fuga desde o início da estimulação visual ou auditivo. (B) a precisão da navegação para o abrigo durante a fuga, medida tal que o valor é 100% se o rato corre diretamente para o abrigo e 10% menos para cada buraco longe do abrigo (EG., 80% se o buraco alcançado primeiro foi dois furos longe de uma correta). (C) deslocamento do mouse durante fuga plotada contra a distância linear entre a posição inicial do animal e o local de destino, mostrando que o voo está perto de linear. Caixa e bigodes mostram dados de percentil 10-90, e os restantes pontos de dados são mostrados como círculos. Os gráficos de cor vermelha são dados de estimulação auditiva (n = 36 respostas de 15 animais) e preto são de estimulação visual (n = 51 respostas de 26 animais). <a href="/files/ftp_upload/56988/56988fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56988/56988fig3.jpg"> Figura 3: ratos não usar pistas visuais proximais ou sugestões relacionados ao abrigo para orientar respostas de fuga. (A) enredo de deslocamento como na Figura 2, para as respostas pré e pós-rotação da plataforma. (B) a precisão da navegação durante fuga em condições pré e pós-rotação. Precisão pós-rotação é medida em referência a localização inicial do abrigo e mostra que os ratos navegar de volta para o local original do abrigo em vez da nova posição. (C) fração de respostas de fuga, direcionadas para o novo local de abrigo, plotado contra número de estimulação. Após a apresentação deth 5 do estímulo, todos os animais escapar diretamente para o novo local de abrigo (n = 9 animais). (D) significa velocidade do outro lado os animais em resposta a estímulos visuais, com um abrigo disponível (vermelho) ou ausente (azul), mostrando a fuga e congelamento respostas, respectivamente. Velocidade foi normalizada para a linha de base e alinhada ao tempo de reação (definido como também o início de um voo ou resposta de congelamento, linha tracejada). Áreas sombreadas mostram SEM. (n = 7 animais). Para 2A e 2B, a caixa e bigodes mostrar dados de percentil 10-90, e os restantes pontos de dados são mostrados como círculos. Os gráficos de cor vermelha são dados de estimulação auditiva antes de rotação da plataforma (n = 25 respostas de 8 animais) e azul são de respostas depois de girar a plataforma (n = 8 respostas de 8 animais). <a href="/files/ftp_upload/56988/56988fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice

Um ensaio comportamental para investigar o papel da memória espacial durante uma defesa instintiva em ratos

Este protocolo descreve um ensaio comportamental, com base no teste de labirinto de Barnes, para estudar como instintiva defensiva ações são modificadas pelo conhecimento do ambiente espacial.

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often ...

a-behavioral-assay-for-investigating-role-spatial-memory-during

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

9.4K visualizações.  UCL Sainsbury Wellcome Centre for Neural Circuits and Behaviour. Este protocolo descreve um ensaio comportamental, com base no teste de labirinto de Barnes, para estudar como instintiva defensiva ações são modificadas pelo conhecimento do ambiente espacial.

Vídeo: A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice

The Double-H Maze: A Robust Behavioral Test for Learning and Memory in Rodents

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their behavioral flexibility and required memory duration, the number of goals and pathways, and also the overall task complexity. A confounding feature in many of these tasks is the lack of control over the strategy employed by the rodents to reach the goal, e.g., allocentric (declarative-like) or egocentric (procedural) based strategies. The double-H maze is a novel water-escape memory task that addresses this issue, by allowing the experimenter to direct the type of strategy learned during the training period. The double-H maze is a transparent device, which consists of a central alleyway with three arms protruding on both sides, along with an escape platform submerged at the extremity of one of these arms.
Rats can be trained using an allocentric strategy by alternating the start position in the maze in an unpredictable manner (see protocol 1; &#167;4.7), thus requiring them to learn the location of the platform based on the available allothetic cues. Alternatively, an egocentric learning strategy (protocol 2; &#167;4.8) can be employed by releasing the rats from the same position during each trial, until they learn the procedural pattern required to reach the goal. This task has been proven to allow for the formation of stable memory traces.
Memory can be probed following the training period in a misleading probe trial, in which the starting position for the rats alternates. Following an egocentric learning paradigm, rats typically resort to an allocentric-based strategy, but only when their initial view on the extra-maze cues differs markedly from their original position. This task is ideally suited to explore the effects of drugs/perturbations on allocentric/egocentric memory performance, as well as the interactions between these two memory systems.

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

O Double-H labirinto: um teste comportamental robusto para Aprendizado e Memória em roedores

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their ...

Comportamento

Assessing Spatial Memory Impairment in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury Using a Radial Water Tread Maze

Despite the recent increase in use of mouse models in scientific research, researchers continue to use cognitive tasks that were originally designed and validated for rat use. The Radial Water Tread (RWT) maze test of spatial memory (designed specifically for mice and requiring no swimming) has been shown previously to successfully distinguish between controlled cortical impact-induced TBI mice and sham controls. Here, a detailed protocol for this task is presented. The RWT maze capitalizes on the natural tendency of mice to avoid open areas in favor of hugging the sides of an apparatus (thigmotaxis). The walls of the maze are lined with nine escape holes placed above the floor of the apparatus, and mice are trained to use visual cues to locate the escape hole that leads out of the maze. The maze is filled with an inch of cold water, sufficient to motivate escape but not deep enough to require that the mouse swim. The acquisition period takes only four training days, with a test of memory retention on day five and a long-term memory test on day 12. The results reported here suggest that the RWT maze is a feasible alternative to rat-validated, swimming-based cognitive tests in the assessment of spatial memory deficits in mouse models of TBI.

Here we present a protocol for a mouse-specific test of cognition that does not require swimming. This test can be used to successfully distinguish controlled cortical impact-induced traumatic brain injury mice from sham controls.

Avaliando a insuficiência da memória espacial em um modelo de mouse de lesão cerebral traumática usando um labirinto de roda de água radial

Despite the recent increase in use of mouse models in scientific research, researchers continue to use cognitive tasks that were originally designed and ...

Analyzing Spatial Learning and Prosocial Behavior in Mice Using the Barnes Maze and Damsel-in-Distress Paradigms

The Barnes maze is a reliable measure of spatial learning and memory that does not require food restriction or exposure to extremely stressful stimuli. The Barnes maze can also assess other mouse behaviors, such as general motivation to escape from the maze platform and exploratory behavior. The Barnes maze can measure whether a genetic mutation or environmental variable can impact the acquisition and retention of spatial memories, as well as provide information about the search strategy employed by the mice. Here we use the Barnes maze to detect a memory deficit in adult mice following a single developmental ethanol exposure event. The newly described Damsel-in-Distress paradigm exposes a male mouse to a female mouse trapped in a chamber in the open center field of the arena. It provides an opportunity for the mouse to socially respond to the trapped female and exhibit prosocial behavior. The Damsel-in-Distress paradigm can also be used to examine mouse behavior in a novel arena and measure locomotor activity. Both the Barnes Maze and the Damsel-in-Distress protocols require minimal financial investment and most aspects of the tests can be constructed from common lab supplies. These flexible and accessible tools can also be used to detect behavioral changes over the course of development.

This protocol measures spatial learning and memory using the Barnes maze. A novel Damsel-in-Distress paradigm is used to assess locomotor activity and prosocial behavior in mice.

Analisando a aprendizagem espacial e comportamento pró-social nos ratos usando o labirinto de Barnes e paradigmas de donzela em apuros

The Barnes maze is a reliable measure of spatial learning and memory that does not require food restriction or exposure to extremely stressful stimuli. ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive decline, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), have become a promising tool to elucidate the underlying mechanisms and promote the therapeutic advances. An important step is the validation and characterization of expected behavioral abnormality in the models, in the case of AD, cognitive decline. The long-term behavioral investigations of laboratory animals to study the effect of aging demand substantial efforts from researchers. The IntelliCage system is a high-throughput and cost-effective test battery for mice that eliminates the need for daily human handling. Here, we describe how the system is utilized in the long-term phenotyping of a genetic Alzheimer&#39;s disease model, specifically focusing on the cognitive functions. The experiment employs repeated battery of tests that assess spatial learning and executive functions. This cost-effective age-dependent phenotyping allows us to identify the transient and/or permanent effects of genes on various cognitive aspects.

This paper describes a protocol for cognitive assessments for genetic models of the Alzheimer&#39;s disease using the IntelliCage system, which is a high throughput automated behavioral monitoring system with operant conditioning.

Automatizada, a longo prazo ensaio comportamental para funções cognitivas em vários modelos genéticos da doença de Alzheimer, usando IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...

Novel Object Recognition and Object Location Behavioral Testing in Mice on a Budget

Ethologically relevant behavioral testing is a critical component of any study that uses mouse models to study the cognitive effects of various physiological or pathological changes. The object location task (OLT) and the novel object recognition task (NORT) are two effective behavioral tasks commonly used to reveal the function and relative health of specific brain regions involved in memory. While both of these tests exploit the inherent preference of mice for the novelty to reveal memory for previously encountered objects, the OLT primarily evaluates spatial learning, which relies heavily on hippocampal activity. The NORT, in contrast, evaluates non-spatial learning of object identity, which relies on multiple brain regions. Both tasks require an open-field-testing arena, objects with equivalent intrinsic value to mice, appropriate environmental cues, and video recording equipment and the software. Commercially available systems, while convenient, can be costly. This manuscript details a simple, cost-effective method for building the arenas and setting up the equipment necessary to perform the OLT and NORT. Furthermore, the manuscript describes an efficient testing protocol that incorporates both OLT and NORT and provides typical methods for data acquisition and analysis, as well as representative results. Successful completion of these tests can provide valuable insight into the memory function of various mouse model systems and appraise the underlying neural regions that support these functions.

Here we provide a protocol which includes comprehensive instructions for the economical establishment of murine object location and novel object recognition behavioral testing, including the design, cost, and construction of required equipment as well as execution of behavioral testing, data collection, and analysis.

Reconhecimento de objetos novos e localização de objeto comportamental testes em ratos em um orçamento

Ethologically relevant behavioral testing is a critical component of any study that uses mouse models to study the cognitive effects of various ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

Uma bateria de testes comportamentais para a avaliação repetida das habilidades motoras, humor e cognição em ratos

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Nest Building Behavior as an Early Indicator of Behavioral Deficits in Mice

Nest building is an innate behavior in male and female rodents, even when raised in laboratory settings. As such, many researchers provide rodents synthetic and/or natural materials (such as twine, tissue, cotton, paper, and hay) as a gauge of their overall well-being and as an ancillary assessment to predict the possible decline in cognition. Typically, changes in nesting behaviors, such as failure to create a nest, indicate a change in health or welfare. In addition, nesting behavior is sensitive to many environmental and physiological challenges, as well as many genetic mutations underlying pathological disease states. The following protocol describes a nesting behavior paradigm that explores the usage of four types of nesting material. In addition, the protocol utilizes intraclass correlations to demonstrate that inter-rater reliability is higher when nests are constructed out of shredded paper compared to other common nesting materials such as cotton squares, paper twists, and soft cob bedding. The chosen methodology and statistical considerations (i.e., intraclass correlation) for this assay may be of interest for those conducting experiments assessing the quality of living of mice.&#160;

Here, we present a protocol to quantify nest building behavior in mice, which is known to be impaired in several neurological disorders and diseases. This protocol examines the utility of four materials and offers the opportunity to quantify the rater agreement in scoring, improving the validity and reliability of the assay.

Comportamento do edifício ninho como um indicador precoce de déficits comportamentais em camundongos

Nest building is an innate behavior in male and female rodents, even when raised in laboratory settings. As such, many researchers provide rodents ...

Estudando Comportamentos Defensivos Ativos em Camundongos com Condicionamento de Medo Modificado

Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

Autor em destaque: Explorando correlatos neurais de comportamentos defensivos na aprendizagem e extinção do medo

To study flight behaviors in a fearful context, we introduce a modified fear conditioning protocol. This protocol ensures that mice consistently exhibit flight behaviors during cue presentation in the fear conditioning.

Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active ...

Um ensaio comportamental para investigar o papel da memória espacial durante uma defesa instintiva em ratos

Resumo

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