Name: mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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GLP-1 imuno-ensaios foram realizados pelo laboratório central Ensaio bioquímica do Hospital de Addenbrooke. Este trabalho tem, ao longo dos anos, foi apoiado pelo Wellcome Trust (atualmente subsídios ativos 106262 / Z / 14 / Z e 106263 / Z / 14 / Z) e do Medical Research Council (MRC) (subvenções MRC_MC_UU_12012 / 3 e MRC_MC_UU_12012 / 5).

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Cambridge Bem-Estar Animal e Ethical Review Body e conformados com os Animais (Scientific Procedures) Act 1986 regulamentos Alteração (SI 2012/3039). 1. Preparação antecipadamente <ol><li> Colocar uma alíquota da matriz da membrana basal (BMM) (~ 200 mL) em gelo para descongelar. NOTA: O BMM solidifica à temperatura ambiente (RT). </li><li> de pré-aquecer a 50 ml de Dulbecco estéril alta-glucose Modified Eagle Médium (DMEM) (sem adições) e ~ 40 mL de meio de cultura estéril (DMEM-elevado teor de glucose suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100U / mL de penicilina e 0,1 mg / mL de estreptomicina (P / S), e 2 mM de L-glutamina) em tubos de centrífuga de 50 ml num banho de água a 37 ° C. </li><li> cálcio Pré-frio e-magnésio contendo fosfato-solução salina tamponada (PBS). </li><li> Pesam-se 15 mg de colagenase (XI em bruto), adicionar a um tubo de centrífuga de 50 mL e mantê-lo em gelo. <ol><li&gt; ATENÇÃO: A colagenase é prejudicial. Ela provoca irritação da pele (H315) e irritação ocular grave (H319). Pode provocar sintomas de alergia ou de asma ou dificuldades respiratórias (H334). Isso pode causar irritação das vias respiratórias (H335). Use equipamento de protecção individual adequado, evitar a formação de poeira e evitar respirar o pó. Assegurar uma ventilação adequada. </li></ol></li></ol> Coleção 2. Tissue <ol><li> Adiciona-se 20 mL de meio L-15 ~ para um tubo de centrífuga de 50 mL e colocá-lo em gelo. </li><li> Eutanásia um rato por deslocamento cervical, ou outro método de programação aprovado 1. NOTA: Intestinal tecido é tipicamente obtido a partir de ratos em um fundo C57BL6. No entanto, outras origens genéticas também têm sido utilizados, por exemplo 129 / SvEv 15. Experiências de imagiologia requerem a utilização de ratinhos repórter fluorescentes, por exemplo GLU-Vénus 1. O tecido é obtido a partir de ratinhos adultos (2-6 meses) de ambos os sexos. Os ratinhos são alojados em individuagaiolas com acesso ad libitum à água e ração normal lly ventilado. No entanto, experimentos para testar o efeito de uma dieta rica em gordura, por exemplo, em função das células enteroendócrinas 16 pode ser executada se apoiado por uma licença de projeto. </li><li> Dissecar e suavemente remover intestino do rato (a partir do piloro até ao início do recto), utilizando fórceps e tesouras de dissecação. Armazená-lo em meio L-15 no gelo até estar pronto para usar. </li></ol> 3. Preparação de tecidos <ol><li> Colocar o tecido intestinal de uma placa de petri de 10 centímetros contendo PBS suficiente para cobrir o tecido. Tomar 10 cm de tecido desejado (por exemplo, intestino delgado superior, parte superior, 10 cm distais ao piloro). </li><li> Expulsar o conteúdo intestinal, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico e refrigerados PBS. <ol><li> Usando fórceps, delicadamente aperto uma das extremidades do segmento intestinal e colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur para ele. Lave com conteúdo refrigerado PBS. Repetir de ambas as extremidades até o majorança dos conteúdos tem sido expelidos. Transferir para um prato de Petri limpo contendo frescos refrigerados PBS. </li></ol></li><li> Usando fórceps, remover o tecido adiposo e mesentério, tendo o cuidado de não retirar a camada muscular, ao mesmo tempo. </li><li> Descasque a camada muscular off &quot;como um meia&quot; sob um microscópio de dissecação utilizando dois conjuntos de pinça fina. NOTA: Este passo não é essencial, mas é altamente recomendado. Existem formas alternativas de remoção da camada muscular ao descrito aqui. Por exemplo, o intestino pode ser cortado longitudinalmente em primeiro lugar, antes da remoção da camada muscular. <ol><li> Encontrar um ponto de partida na extremidade mais proximal do tecido onde existe uma aba visível do músculo. Suavemente afastar uma pequena quantidade da camada de músculo a toda a volta do intestino. NOTA: Para evitar rasgar da camada muscular ou o epitélio intestinal, diminuir a força de tensão de aperto por uma maior área de superfície, em vez de utilizar a tips das pinça fina. </li><li> Prender o intestino e o máximo da aba músculo quanto possível, suavemente separar e começar descascando a camada muscular de todo o intestino. Para evitar rasgar tanto a camada muscular e epitélio, manter reajustar a posição das pinças para mantê-los juntos fechar. Desta maneira, remover a camada de músculo de todo o comprimento do segmento intestinal e descarte. </li></ol></li><li> Cortar o intestino aberta longitudinalmente e lavar por agitação numa placa de Petri limpa com PBS fresco arrefecido. Repetir se necessário, para remover qualquer remanescente quimo ou muco. </li><li> Tecido tritura com uma lâmina de bisturi cirúrgico para alcançar quadrados de ~ 1-2 mm 2 e adicioná-los para ~ 20 mL refrigerados PBS num tubo de centrífuga de 50 ml usando uma pipeta de Pasteur. Para evitar pedaços de tecido que colam à pipeta, cortou a ponta e molhar a pipeta por trituração com PBS. </li><li> Agitar suavemente o tubo de lavagem ainda mais os pedaços de tecido. Permitir que o tecido para se estabelecer e derramar ou pipette fora a maioria da PBS e repita com PBS fresco até que a PBS parece clara. </li></ol> 4. Preparação de BBM-revestidos / placa pratos e digestão Médio NOTA: As etapas a seguir devem ser realizadas numa capa de cultura de tecido (com os passos de incubação de 37 ° C Banho de água). <ol><li> Prepara-se uma solução de BMM 2% em DMEM gelado (sem adições). Enquanto trabalhava, manter a solução em gelo. Para obter uma solução a 2%, adicionar 140 mL de BMM descongeladas a 7 ml de DMEM (suficiente para preparar uma única placa de 24 poços). <ol><li> Adicionar 250 uL de 2% de solução de BMM por poço (placa de 24 pos) ou por placa de imagiologia com fundo de vidro. </li><li> Incubar placas revestidas / pratos durante pelo menos 30 minutos num incubador a 37 ° C para permitir a polimerização adequada do BMM. </li></ol></li><li> Adicionar DMEM a 50 mL de pré-aquecido (sem adições) a 15 mg de colagenase (a partir de etapas 1.2 e 1.4) para formar uma solução de 0,3 mg / mL e inverter a dissolver-se. <ol><li> Emce completamente dissolvido, utilizando uma seringa de 20 mL, filtrar a solução de colagenase através de um filtro estéril de 0,2 um para um novo tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Rotular este como o meio de digestão. </li></ol></li></ol> Digestão 5. Tecido <ol><li> Remover os pedaços de tecido a partir do PBS utilizando uma pipeta serológica 10 e adicionar a um tubo esterilizado de 50 ml de centrífuga contendo DMEM estéril gelada (sem adições), redemoinho e então remover DMEM. NOTA: Para evitar tecido adere ao pipeta serológica, molhá-lo por meio de trituração com DMEM antes do contacto com o tecido. </li><li> &#39;Digest&#39; 1 e 2: A remoção de detritos celulares e as células individuais <ol><li> Adicionar 7 meio de digestão mL para os pedaços de tecido e dar o tubo de um redemoinho. </li><li> Incubar durante 5 min num banho de água a 37 ° C. </li><li> Agitar suavemente (não rodam) do tubo durante ~ 3 s. </li><li> Permitir que o tecido para se estabelecer e desfazer o meio de digestão, reservando umpequeno volume para olhar sob o microscópio. NOTA: Especialmente quando se inicia, é altamente recomendável para inspeccionar um pequeno volume de cada &#39;digerir&#39; (~ 30 mL) sob o microscópio para medir o progresso do processo de digestão. Se muitas criptas são observadas nesta fase, o tremor pode ser muito vigorosa. Para imagens representativas de que estágios diferentes &#39;digerir&#39; normalmente se parecem, consulte a Figura 1. </li><li> Repetir Passos 5.2.-5.2.4 (com meio fresco a digestão). </li></ol></li><li> 3 a 5 &#39;digere&#39;: colecção de fragmentos de criptas <ol><li> Adicionar 7 meio de digestão mL para o tecido. </li><li> Incubar durante 10 min a 37 ° C. <ol><li> Durante a incubação, agitar a cada 5 min durante 10-12 s. NOTA: A agitação é mais vigoroso do que a agitação durante &#39;digere&#39; 1 e 2. </li></ol></li><li> Permitir que o tecido não digerido para assentar e recolher o meio de digestão num tubo de centrífuga de 15 mL. E setecido é recolhido acidentalmente juntamente com o meio, permitir que a resolver, removê-lo usando uma pipeta serológica de 10 mL e transferi-lo de volta para o tubo de centrífuga de 50 mL contendo o tecido não digerido. </li><li> Centrífuga recolhido médio / sobrenadante à temperatura ambiente durante 3 min a 100 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura de 5 mL de pré-aquecido por trituração suave e posto de lado. </li><li> Inspeccionar um pequeno volume da suspensão de células sob o microscópio (ver Nota do Passo 5.2.4). NOTA: Idealmente, os fragmentos da cripta começam a aparecer em &#39;digerir&#39; 3, juntamente com os resíduos celulares e as células individuais. &#39;&#39; Os digeridos 4 e 5 contêm um número significativamente maior de fragmentos cripta com detritos celular reduzida (Figura 1). Ajustar agitação intensidade como necessário, ou seja, se o tecido não está digerindo e fragmentos das criptas não estão a aparecer, agitação mais vigorosa. </li><li> Repita os passos 5.3.1-5.3.6 até 5 &#39;digere&#39; ter sidoconcluída ou até que a maioria do tecido foi digerido (a 6 th resumo pode ser necessária). </li><li> Uma vez que todos os sobrenadantes de &#39;digere&#39; 3-5 (ou 3-6) foram colhidos, centrifugar os sobrenadantes digerir a TA durante 3 min a 100 x g. </li><li> Para as experiências de secreção, combinam-se os sobrenadantes a partir de &#39;digere&#39; 3-5 (ou 3-6) antes da centrifugação. NOTA: Menos tecido é necessária para experiências de imagiologia, por conseguinte, escolher o sobrenadante digesto que é o mais limpo (ausência de fragmentos de células e as células individuais) com o maior número de fragmentos da cripta. Este é tipicamente &#39;digerir&#39; 4 ou 5. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento por trituração até que não há aglomerados são visíveis. Re-suspender o sedimento em meio de cultura pré-aquecido suplementado com 10? M Y-27632 dicloridrato (para evitar a anoikis 17). Use 5 ml para experiências de secreção e 2 mL de meio de cultura para experiências de imagiologia. </li><li> Filtrosuspensão de células através de um filtro de 100? m (para remover qualquer tecido não digerido). Executar um adicional de 2 mL de meio de cultura pré-aquecido através do filtro para lavar (volume total: 7 mL e 4 mL, para a secreção e de imagem, respectivamente). Nota: A filtragem não é essencial, no entanto, fragmentos de tecido maiores não tendem a aderir à placa / pratos. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figura 1: Imagens representativas de &#39;&#39; digestões de método de cultura primária do intestino delgado. (A) Material típico a partir de 1 &#39;e 2&#39; digere as células contendo principalmente individuais e os detritos celulares. (B) Um exemplo de produtos de &#39;digerir&#39; 3. As setas pretas indicam fragmentos da cripta que aparecem no material de digerir. (C) típica de &#39;digerir&#39; 4 ou 5. O painel (D) representa reunidas digerir o material de&#39;digere&#39; 3-5 passado através de um filtro de 100? m para remover os fragmentos de tecido maiores indesejáveis observados em (C). Todas as imagens foram tiradas com um microscópio invertido digital com um objetivo 20X. Barras de escala = 100 pm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 6. Galvanização culturas intestinais (enriquecidas em células da cripta) <ol><li> Remover o excesso de solução de BMM da placa ou pratos, e adicionar 250 uL de meio de cultura pré-aquecido por secreção bem. NOTA: Imagens pratos são deixadas sem meio de assim proceder para o próximo passo rapidamente para evitar que o prato de secar. </li><li> Placa 250 pL de suspensão de células por poço (placa de 24 pos) ou por prato de vidro de fundo. <ol><li> Placa gota a gota, em um movimento lento &#39;zig-zag&#39; do outro lado do poço. Permitir fragmentos cripta se contentar com ~ 5 min antes de mover a placa para the incubadora. NOTA: Este deve incentivar uma distribuição uniforme das criptas / células dentro do poço. </li></ol></li><li> Incubar a placa ou placas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. NOTA: Uma monocamada &#39;irregular&#39; deve ter se formado. Para obter uma imagem representativa de culturas seguintes três lavagens, ver Figura 2A. </li><li> pratos de imagem &#39;inundação&#39; com 2 mL de meio de cultura pré-aquecido por prato. NOTA: Estes pratos serão adequados para imagiologia por até ~ 72 h após plaqueamento. culturas do cólon geralmente duram mais tempo, até 7 dias. As células que não aderiram podem ser removidos por um passo de lavagem. As culturas primárias está agora pronto para ser usado para experimentos. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos para permitir o estudo da secreção de péptido intestino e imagens de células isoladas de células do enteroendócrinas marcados. Para aumentar a probabilidade dos pequenos culturas intestinais ser bem sucedido, é importante que o protocolo é levada a cabo tão rapidamente quanto possível (de preferência, dentro de 3 h de colheita do tecido) e de que o tecido é mantido em meio arrefecido com gelo ou tampão antes para o processo de digestão, para limitar a morte celular. Enquanto não é essencial, especialmente para as culturas do cólon, remoção da camada muscular do intestino delgado é fortemente encorajada. A pequena protocolo de cultura intestinal foi padronizado, tanto quanto possível. No entanto, é importante notar que nenhum processo de digestão é idêntico. Existem muitos passos durante este protocolo em que a variabilidade pode ser introduzido numa base dia-a-dia, por exemplo o grau de remoção do músculo, o tamanho de tele &#39;picada&#39; pedaços de tecido, a força de agitação, a potência de um determinado lote de colagenase etc. É, por conseguinte, da maior importância para inspeccionar alíquotas de cada um dos diferentes &#39;digere&#39; sob o microscópio para avaliar o progresso do processo de digestão e adaptar a agitação e o número de conformidade &#39;digere&#39;. Recomenda-se a agitar mais suavemente para começar e, se fragmentos cripta não são óbvias a partir de &#39;digerir&#39; 3 em diante, para começar a tremer de forma mais vigorosa. Pela nossa experiência, as células enteroendócrinas não proliferar em cultura e geralmente são perdidos a partir de pequenas culturas intestinais dentro de 4 dias. Não obstante, isto permite tempo suficiente para efectuar experiências de secreção de péptido intestino (tipicamente levada a cabo ao longo de 2 h, 18-24 h ap plaqueamento) para testar a estímulos fisiológicos e / ou agentes farmacológicos. As experiências que requerem uma incubação durante a noite anterior à experiência secreção são também, por exemplo viávelno caso de pré-tratamento com toxina da tosse convulsa 15. A técnica de cultura primária aqui apresentada é um método bem estabelecido, como evidenciado pelo volume de produção de pesquisa tem produzido ao longo dos anos. O modelo de cultura primária foi usado para estudar a secreção de uma variedade de péptidos do intestino, incluindo GLP-1 1, GIP 18 e PYY 19, em resposta a nutrientes diversificada e não nutrientes 14, 20 estímulos e inibidores. Além disso, a mesma técnica tem sido aplicada com sucesso para a cultura de células intestinais humanas 21. Muitas vezes, uma combinação do método de cultura de células primária, juntamente com um modelo experimental adicional por exemplo. ex vivo ou in vivo pode proporcionar a visão mais 6. Notavelmente e em contraste com outros métodos, esta técnica tem importantes aplicações para além da medição da libertação do péptido intestinal. Nós demonstramos que as pequenas culturas intestinais primárias derivadas de ratinhos transgénicos repórter são poderosos instrumentos para a interrogação de vias de sinalização intracelular acoplados a gut secreção de péptidos, usando, por exemplo, o Ca2 + e sensores de cAMP, GCaMP3 11, 13 e Epac2camps 14, respectivamente, bem como técnicas electrofisiológicas 12. Tal como acontece com todos os modelos in vitro, as culturas primárias intestinais têm certas limitações inerentes, incluindo a perda de polaridade das células epiteliais em cultura, bem como a perda de fornecimento de sangue e inervação. É difícil estimar os potenciais impactos destas condições artificiais em função das células enteroendócrinas. No entanto, os dados obtidos a partir de culturas primárias têm sido frequentemente traduzíveis na in vivo Setting (por exemplo, efeitos de ácidos gordos de cadeia curta sobre a secreção de GLP-1 15). As culturas intestinais primárias são uma técnica versátil com muitas aplicações potenciais. Eles já forneceram importantes insights mecanicista para a regulação da secreção de péptidos intestino.

O objectivo global do presente método é isolar e células intestinais murino cultura mista para permitir o estudo da secreção de péptido intestino e imagem de células vivas de células enteroendócrinas. Uma versão anterior do presente processo foi originalmente publicado em 2008 por Reimann et al. 1 e formou uma vez que a base de mais de 20 publicações do nosso grupo. Para este manuscrito, optamos por concentrar em pequenas culturas intestinais como eles são mais difíceis de estabelecer que as culturas do cólon. Células Enteroendócrinas secretar uma variedade de péptidos do intestino, incluindo péptido tipo glucagon 1 (GLP-1), péptido insulinotrópico (GIP) dependente da glicose, colecistoquinina (CCK) e péptido YY (PYY) 2. Estes péptidos intestinais têm funções fisiológicas importantes em orquestrar respostas pós-prandial, tais como o retardamento do trânsito intestinal, a potenciação da libertação de insulina estimulada por glicose e a indução de saciedade. GLP-1 um miméticosnd fármacos que inibem a sua degradação são actualmente licenciado para o tratamento da diabetes tipo 2 e não é contínua avaliação do potencial terapêutico da estimulação da secreção endógena deste péptido 3. Uma melhor compreensão da fisiologia enteroendrina e os mecanismos pelos quais a secreção é ou estimuladas ou inibidas é, portanto, de importância crítica. Gut a secreção do péptido pode ser estudado usando uma variedade de ensaios in vitro e modelos experimentais ex vivo, cada um deles com vantagens e desvantagens (para uma recente revisão abrangente cobrindo também o uso de modelos in vivo ver Svendsen et al. 4). Técnicas ex vivo, tal como o intestino e cinco câmaras de Ussing 6 perfundidos isolados estão actualmente a ser utilizados para explorar a secreção do péptido intestino em resposta a várias substâncias. A principal vantagem destes métodos, conformeem comparação com culturas primárias, é que o ambiente imediato das células enteroendócrinas permanece praticamente intacta e importante, a polaridade das células é preservada. Portanto, é possível obter informações sobre o qual a superfície de células de um secretagogo está agindo em 6. No entanto, estes são tipicamente técnicas de baixo rendimento e a qualidade dos dados derivados a partir deles baseia-se fortemente na integridade e viabilidade do tecido intestinal, o que, inevitavelmente, diminuir ao longo do tempo. Organóides intestinais são agora cada vez mais a ser utilizados como modelos in vitro para o estudo da função celular enteroendrina e desenvolvimento 7. Organóides, que podem ser derivados tanto de murino e o tecido humano, tem a vantagem de formar estruturas 3D &#39;cripta-like&#39;, que mantêm a polaridade celular em cultura. No entanto, as células enteroendócrinas organï¿½de-derivado tem ainda de ser completamente caracterizados e a sua semelhança com L cel nativals permanece em grande parte desconhecido. As culturas primárias tem a vantagem de ser mais um passo para a definição fisiológica, como células enteroendócrinas não são mantidas e diferenciadas em condições artificiais, por períodos prolongados de tempo. Um método de cultura principal alternativa que tem sido utilizado para a avaliação da secreção de péptido intestino é o isolamento de células de intestino de rato fetal (FRICS) 8. No entanto, a cultura de tecido intestinal adulto reuniu-se com menos sucesso e algumas diferenças foram observadas na resposta de FRICS comparada adultos células intestinais de murino (por exemplo, glicose 8). Linhas celulares Enteroendócrinas semelhante (por exemplo, GLUTag, STC-1 e NCI-H716) foram tradicionalmente utilizados para distinguir directa vs. efeitos indirectos sobre células enteroendócrinas e para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes acoplamento estímulo para a secreção; ver Kuhre et al </em&gt;. 9 para a produção de péptidos e a secreção por linhas celulares imortalizadas &#39;semelhantes a células L&#39;. Esta foi necessário como células enteroendócrinas, espalhados ao longo do trato gastrointestinal, constituem pouco menos de 1% das células epiteliais do intestino 10 e células classificadas, em nossas mãos, não sobrevivem na cultura 1. As linhas celulares que permanecem ferramentas úteis devido ao facto de que eles são uma população de células, em grande parte homogénea que é propício para manipulações genéticas, tais como o gene silenciador. Por conseguinte, é fácil de investigar o papel das proteínas que não podem ser segmentados farmacologicamente, quando os ratinhos transgénicos não estão disponíveis. No entanto, as linhas celulares não são sempre modelos válidos de células primárias. Embora existam muitas semelhanças, os resultados de culturas primárias têm destacado na ocasião diferenças nas vias de sinalização ativadas por certos nutrientes em células L primários em comparação com células GLUTag, por exemplo (por exemplo. Peptonas &lt;classe sup = &quot;xref&quot;&gt; 11). Fundamentalmente, em combinação com ratinhos transgénicos repórter fluorescentes, o modelo de cultura primária permite o exame detalhado das células individuais enteroendócrinas primária a nível intracelular. Células L fluorescentemente marcadas dentro de culturas primárias têm sido utilizados pelo nosso grupo para remendo de aperto 1, 12 estudos, e de uma única célula de cálcio 11, 13 e adenosina cíclico imagiologia monofosfato-FRET 14 estudos, que produziram avanços significativos no campo da enteroendrina fisiologia. O seguinte protocolo foi optimizado para a realização de experiências de secreção, utilizando uma placa de 24 poços ou para a preparação de até 16 pratos de imagem, a partir de uma secção de 10 cm do intestino delgado a partir de um único rato adulto. O protocolo pode ser facilmente modificado para o estudo de células do cólon, aumentando a tempos de digestão e coconcentração llagenase.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>For secretion experiments</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL, sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>For tissue preperation/digestion</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL, sterile</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430828</td><td>For tissue preperation/ digestion</td></tr><tr><td>Collagenase XI (Crude)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>For making up digestion medium</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>DMEM High glucose (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>For dissolving matrigel (keep at 4 &amp;deg;C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Forceps/Tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>High precision tweezer (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>For removing muscle layer</td></tr><tr><td>High resolution digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>For collecting tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td></tr><tr><td>MetaFluor&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td><td>-</td><td>Fluorescence ratio imaging software</td></tr><tr><td>Mice (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td></tr><tr><td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>in house</td><td>-</td><td>For calcium imaging and secretion experiments</td></tr><tr><td>Microscope (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>For photomicrographs of cultures</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>For cleaning tissue</td></tr><tr><td>PBS containing Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>For washing tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>Penicillin &amp;amp; Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Sterile cell strainer 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td></tr><tr><td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>For dicing tissue</td></tr><tr><td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &amp;micro;m pore size)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Xenon arc lamp 75W</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)</td></tr></tbody></table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

O intestino é o maior órgão endócrino do corpo, com células enteroendócrinas secretores de hormona localizados ao longo do comprimento do epitélio gastrointestinal. Apesar da sua importância fisiológica, as células enteroendócrinas representam apenas uma pequena fracção da população celular epitelial e no passado, a caracterização apresentou um desafio considerável, resultando em uma dependência em modelos de linhas celulares. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e cultivo de células do intestino delgado murino mistos. Estas culturas primárias têm sido utilizados para identificar as vias de sinalização subjacentes a estimulação e inibição de secreção de péptido intestino em resposta a um número de nutrientes e neuropeptídeos, bem como agentes farmacológicos. Além disso, em combinação com a utilização de ratos transgénicos repórter fluorescentes, que têm demonstrado que estas culturas primárias tornar-se uma ferramenta poderosa para o exame de células enteroendócrinas marcadas com fluorescência no emnível tracellular, utilizando métodos tais como patch clamping e de cálcio de uma única célula e imagiologia de cAMP-FRET.

A utilização de passos de digestão em série permite a recolha de uma preparao relativamente limpa de fragmentos de criptas a ser plaqueadas para experiências. As primeiras duas digestões de remover as células principalmente individuais e detritos celulares a partir do material de digestão (Figura 1A). Durante o terceiro digestão, fragmentos de criptas aparecem no material digerido (Figura 1B). Digere 4 e 5 rendimento de um maior número de fragmentos cripta com menor número de células individuais (Figura 1C). Filtrando o material reunido a partir de digestões de 3-5 remove pedaços maiores de tecido não digerido, os quais podem ser prejudiciais para a cultura, produzindo uma preparação de fragmento cripta limpo (Figura 1D). Seguindo 18-24 h de cultura, as monocamadas de células intestinais pequenas primárias são observados (Figura 2A). Utilizando culturas gerados a partir de ratinhos transgénicos que expressam especificamente a calCium de sensor fluorescente, GCaMP3, sob o controlo do promotor de proglucagon 11, células L são facilmente identificáveis e intercaladas dentro da cultura (Figura 2B). Em pequenas culturas primárias intestinal, os compostos alvo a L q -Ca 2+ i e i AMPc dependente de vias estimulada a secreção do GLP-1 (para a metodologia ver experiência secreção Reimann et al. 1). A bombesina (BBS, 100 nM) e a co-aplicação de forscolina e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (M / I, 10? M cada) desencadeou uma estimulação 2- e 11-vezes, de GLP-1 de libertao relativamente basais, respectivamente (Figura 2C). expressão celular específica de G GCaMP3 permite a identificação e a monitorização em tempo real de mobilização de cálcio em células L individuais. Ambos 100 nM bombesina (BBS) e cloreto de potássio 30 mM (KCl) estimulou aumentos transitórios no cálcio intracelular indicativos do conhecido L q &lt;/ sub&gt; - e vias electrogénica acoplada em células L primárias (Figura 2D). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figura 2: Os dados representativos obtidos a partir de pequenas culturas primárias intestinais. Exemplo de imagens pequenas culturas intestinais mistas primárias utilizadas para (A) e a secreção de experiências de imagiologia (B) pós 24 h chapeamento. (A) A imagem obtida a partir de uma placa de 24 poços, utilizando um microscópio invertido digital com uma objectiva de 4X. Barra de escala = 500 pm. (B) Utilizando GLU-Cre x ratinhos ROSA26 GCamP3, culas L no campo de visão (células verdes) foram identificados pela fluorescência de GCaMP3. A barra de escala representa 50 um. (C) de GLP-1 a secreção foi medida em resposta à bombesina (BBS, 100 nM) e forscolina / 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (M / I, 10? M cada). Percentagem secreção de GLP-1 foi calculadapor medição dos níveis de GLP-1 em sobrenadantes e lisados ​​celulares. Os dados representam as médias ± SEM de n = 3 para cada condição. (D) fluorescência GCaMP3 (reflectindo cálcio citosólico) das duas células descritos em (B) monitorizados em tempo real, em resposta ao cloreto de potássio (KCl, 30 mM) e BBS (100 nM). imagiologia de célula única foi realizada utilizando um microscópio invertido de fluorescência com uma objectiva de imersão em óleo de 40X. GCaMP3 foi excitada a 475/10 nm, utilizando uma lâmpada de arco de xénon de 75 W e um monocromador controlado por software de imagem de fluorescência. Emissão foi registada com uma câmara de alta resolução digital de dispositivo de carga acoplada (CCD), usando um espelho dicróico e um filtro de largura de banda de 510-560 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K visualizações.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge.  Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas. 

Vídeo: Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Bioengenharia

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Biologia do Desenvolvimento

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medicina

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Os mecanismos subjacentes a secreção do hormônio Gut usando o isolado perfundido intestino de rato

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Imunologia e Infecção

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biologia

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e Célula-Tronco Única

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor em destaque: A cultura 3D de organoides de criptas intestinais murinas e uma única célula-tronco para pesquisa de organoides  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...