Name: magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
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Pedimos gentilmente agradecer Sabine Reckinger para excelente assistência técnica e apoio.

1. Preparações <ol><li> coleta de amostras Nota: O método de agitador magnético pode ser utilizado para as amostras musculares individuais ou agrupados. <ol><li> Recolher amostras dos locais de predilecção apropriados e em uma quantidade adequada 9. Refira-se às exigências do país ou para as recomendações de TIC, OIE ou ISO. <ol><li> Para a União Europeia, por exemplo, tirar uma amostra de 1 g de um dos pilares do diafragma na zona de transição para a parte tendinosa de suínos domésticos. Certifique-se de que todas as amostras musculares estão livres de toda a gordura e fáscia. </li></ol></li><li> Se a língua é testado, remover a camada superficial antes do teste. </li><li> Tome cuidado se as amostras são congeladas, como a maioria das larvas Trichinella não são congelar resistente e desenrole após a morte, são menos resistentes à digestão e tendem a aderir às paredes do recipiente, resultando em diminuição da sensibilidade do ensaio. Nota: Se congelado, o dobro do tamanho da amostra em lleste e aumentar o tempo de sedimentação (ver abaixo). </li></ol></li><li> Preparação do líquido de digestão <ol><li> Adicionar HCl a 25% (16 ± 0,5 mL) para 2 L de água da torneira pré-aquecida a 46-48 ° C em um copo de vidro de 3 litros. Muito baixo de uma temperatura resulta na digestão incompleta; muito alto de uma temperatura desactiva as propriedades enzimáticas da pepsina. </li><li> Colocar uma barra de agitação no recipiente, e agita-se a solução sobre uma placa pré-aquecida (46-48 ° C). </li><li> Adicionar 10 ± 0,2 g de pepsina (1: 10000 NF, 1: 12500 BP, 2000 FIP) para a solução ácida. Nota: A qualidade da pepsina é de extrema importância e atividade da enzima deve ser certificado pelo produtor. Por razões de segurança laboratoriais e manter a actividade da pepsina, a sequência da adição de componentes de fluidos de digestão devem ser respeitados. </li></ol></li><li> Preparação de amostras do músculo <ol><li> Pique até 100 g de amostras de músculo em um liquidificador ou moedor. Para facilitar blending, adicione 2 mL pré-aquecido água para as amostras e misture em velocidade máxima para 2 - 3 s. </li><li> Antes da segunda mistura, abrir o misturador e transferir qualquer amostra de músculo no topo da margem da borda tigela de mistura para a parte inferior e a mistura de repetição. Continue misturando com rajadas de 2 - 3 s até que não haja pedaços visíveis de carne permanecem. Nota: Muito pouco de mistura pode resultar na digestão incompleta, enquanto muito mistura pode danificar o Trichinella larvas presentes nas amostras 6. </li></ol></li></ol> 2. Procedimento <ol><li> Digestão de amostras do músculo <ol><li> Transferir 1 L de fluido de digestão em forma de cilindro. Transfira a carne moída no copo e difundir no fluido de digestão com uma colher ou garfo. Enxaguar a taça tampa do copo misturador, lâmina e liquidificador com 500 ml do líquido de digestão pré-aquecido para a 3 L proveta. Nota: lavagem incompleta pode resultar na perda de Sensitivity. </li><li> Cobrir a proveta com folha de alumínio e manter uma temperatura constante de 44-46 ° C e monitor com um termómetro. </li><li> Agita-se a digestão de fluido durante 30 min para criar um vórtice sem salpicos de profundidade até que as partículas de carne desapareçam. Dependendo do tipo de carne testada (por exemplo, carne de animais selvagens), aumentar o tempo de digestão, até um máximo de 60 minutos. </li></ol></li><li> A filtração e sedimentação do líquido de digestão <ol><li> Para determinar a quantidade de tecido não digerido, ajustar a escala a zero, pese a peneira antes de usar, e anote o seu peso. A peneira deve estar limpa e desprovida de quaisquer partículas de tecido, o que poderia dificultar as larvas Trichinella atingir o funil de sedimentação. Verifique se o funil de separação é nivelado verticalmente. </li><li> Após a digestão, enchimento com o líquido de digestão através de um crivo de 180 um para uma ampola de separação de vidro. A largura do funil de separação de vidro não deve be maior do que 55% do comprimento para permitir uma boa sedimentação larva. Tome cuidado para evitar qualquer excesso. </li><li> Para evitar a perda de sensibilidade, lavar bem o copo de vidro e a peneira com cerca de 200 ml de água da torneira de um frasco de lavagem e transferir a água da lavagem para o funil de sedimentação de vidro. Ter o cuidado de lavar cuidadosamente as bordas do recipiente de 3 L. Levantar o crivo e lavar a área sob a peneira completamente. </li></ol></li><li> Determinação da quantidade de tecido não digerido Nota: devido a erros na execução do método, o tecido muscular pode permanecer no peneiro, como bem fáscia e do tecido conjuntivo, que não são digeríveis. A quantidade de tecido não digerido é determinada durante o primeiro passo de sedimentação de 10 minutos (ver 2.5). Isto permite cerca de 30 min para a peneira para secar, tal como água residual pode influenciar o peso determinado do tecido não digerido. <ol><li> Coloque uma toalha de papel em uma escala, e pesar o crivo que tem os undigestecidos ted. </li><li> Subtrair o peso peneira antes da filtração do peso peneiro com tecidos não digeridos. O processo de digestão é considerada satisfatória se não mais do que 5% do peso inicial da amostra permanece no peneiro (isto é, 5 g / 100 g de material de partida). </li><li> Se a quantidade de tecido não digerido é superior a 5%, repetir o teste usando amostras de músculo fresco. Se o tecido restante é predominantemente composta de tecido muscular não digerido e amostras frescas não estão disponíveis, digerir os restos não digeridos novamente e analisar, em adição às amostras originais. </li></ol></li><li> A sedimentação do líquido de digestão <ol><li> Manter o líquido de digestão filtrada no funil de separação durante 30 min. Se deixado em repouso, as larvas Trichinella vai assentar no fundo do funil. </li><li> Se forem utilizadas amostras congeladas, aumentar o tempo de sedimentação para um máximo de 60 minutos. </li><li> Uma vez que a sedimentação é completa, abra totalmente a torneirado funil de separação para permitir que, pelo menos, 40 ml do fluido de digestão rápida fugir em um cilindro de medição (80 mL se amostras do músculo tinha sido previamente congelado). </li><li> Em primeiro lugar, vamos metade do fluido para dentro do cilindro e, em seguida, abrir completamente a válvula na direcção oposta para permitir que 10 mL de fluido de digestão para passar. Finalmente, abrir a torneira de passagem no sentido oposto por mais 10 ml. Este procedimento garante que Trichinella larvas não são presos na torneira. Nota: velocidade suficiente é necessária para evitar larvas restante no funil de separação, diminuindo a sensibilidade. </li></ol></li><li> A sedimentação do líquido de digestão no cilindro <ol><li> Deixar o sedimento no cilindro, durante 10 min para permitir que as larvas se sedimentar. Retirar 30 ml de sobrenadante por aspiração com uma pipeta, sem perturbar o sedimento de 10 mL. </li><li> Para reduzir a quantidade de fibras de tecido na amostra, adicionar 30 mL de água da torneira para o sedimento e sair para o outro a 10 m. Repita até que o líquido é clara. </li><li> Remover o sobrenadante e transferir os 10 ml lavado sedimentos para uma placa de Petri em grade ou bacia para a contagem das larvas. Lavar o cilindro com 10 mL de água da torneira e, em seguida, adicionar a água à amostra. Observação: Como grandes quantidades de detritos no interior da amostra pode impedir a identificação das larvas Trichinella (Figura 1), mais passos de lavagem deve ser realizada, se necessário. </li></ol></li><li> Exame microscópico <ol><li> Use um triquinoscópio ou um estereomicroscópio com uma fonte de luz sub-estágio transmitida de intensidade ajustável em um 15 a ampliação de 20x para examinar as amostras imediatamente após as etapas de lavagem. </li><li> Após o vazamento da amostra na placa de Petri em grade, examine o prato / bacia sistematicamente rede pela grade. Se não houver estruturas suspeitos são encontrados, mova suavemente o líquido na placa de Petri em grade ou bacia para a contagem das larvas em uma forma circular para permitir que qualquer la Trichinellarvae, que foram potencialmente negligenciado, a acumular-se no centro da placa de Petri. Repetir o exame. </li><li> Se uma estrutura suspeito é encontrado, aumentar a ampliação de 40 - 100X. Remover Trichinella larvae do prato / bacia com uma pipeta e recolher num tubo com 90% de etanol. </li><li> Após o prato completo foi examinado, repetir o procedimento, a partir da agitação suave do prato / bacia. Repita o procedimento pelo menos três vezes ou até não mais larvas são encontradas. </li><li> Contar o número de larvas. Correlacionam-se com a quantidade de tecido muscular testado e presente como larvas por grama (GLP). </li><li> Se muitas larvas estão presentes no fluido de digestão para determinar o número de larvas de forma confiável, o retorno do fluido contendo as larvas para o cilindro de medição, enxaguar com água da torneira de um frasco de lavagem, e deixar que as larvas se depositam no fundo. </li><li> Depois de um tempo de sedimentação de 10 minutos, reduz-se o sobrenadante a um volume definido (por exemplo,10 mL). Para determinar o volume exacto, transferir o sobrenadante para um novo cilindro com uma pipeta. </li><li> Suspender larvas homogeneamente no fluido, por agitação vigorosa. Durante o movimento de agitação, adicionar 12 gotas de 20 ul de suspensão de larvas para uma placa de Petri. </li><li> Examine cada gota por microscópio. Determinar o número de larvas em 240 mL e apagar a contagem mais alta e mais baixa. Extrapolar o número de larvas para o volume total (por exemplo 10 ml) de sobrenadante. Nota: A qualidade do microscópio estéreo é de suma importância para a identificação de larvas de Trichinella. </li><li> Quando as larvas são coletadas em um tubo por uma pipeta, verifique cuidadosamente que as larvas não ficar na parede da pipeta, mas transferidos para o tubo. Nota: achados triquinas positiva a partir de amostras colectivas deve ser rastreada a partir da piscina para a carcaça de origem. Aqui, o tamanho da piscina deve ser progressivamente reduzido até que a carcaça positiva é idencado. O tamanho da amostra também pode ser aumentada durante este processo para aumentar a sensibilidade. Sempre que o exame de uma amostra colectiva produz um resultado positivo ou duvidoso, uma amostra de 20 g é retirada de cada porco. As amostras de 20 gramas provenientes de cinco suínos devem ser reunidas e examinadas usando o método descrito. Desta forma, serão examinadas amostras de 20 grupos de cinco suínos. Se forem detectadas triquinas numa amostra combinada de cinco suínos, amostras de 20 gramas são recolhidos a partir dos porcos individuais no grupo e cada um é examinado separadamente até que seja detectada a carcaça positiva de origem. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Embora o método de agitador magnético pode ser facilmente realizada, não cumprir rigorosamente a detalhes técnicos leva a sensibilidade insuficiente, pondo assim em risco a saúde do consumidor. Os pontos críticos de controle foram destacadas no texto acima. Além disso, a utilização de equipamento adequado é crucial para o resultado positivo do teste. Todos os navios devem ser feitas de vidro e pipeta pontas revestidas com silicone para reduzir a aderência de larvas para a superfície. A sensibilidade do método de digestão depende da densidade larvar nos músculos e a quantidade de amostra de músculo testado. Para obter uma densidade larvar de 3-5 gpl de tecidos musculares, uma sensibilidade de 100% foi relatado, mas abaixo de 1 gpl a sensibilidade caiu para 40% 13. Dependendo da espécie hospedeira animais testados, a sensibilidade do teste pode ser melhorada através do aumento da quantidade de amostra utilizada. o ifardo nfection em vida selvagem é geralmente baixa, portanto, maiores tamanhos amostras são utilizados 14. Os locais de predilecção também variam entre os animais hospedeiros. Aqui, a digestibilidade inferior de alguns tecidos musculares, tais como a lingueta deve ser tomado em consideração, que também pode resultar em tamanhos de amostra maior 15. Além disso, é importante entender que o método de agitação magnética não incluir controlos internos. Portanto, o gerenciamento de garantia de qualidade da amostragem de documentação é essencial para obter resultados precisos e precisos. A qualidade do desempenho do laboratório para detecção de triquinas larvas em amostras do músculo deve ser monitorizada através da participação regular de cada analista em ensaios de proficiência. Outras limitações do método são que a etapa de identificação do final do músculo larvas por microscopia é altamente subjectiva e HEAvily dependente do conhecimento da morfologia das larvas pelo analista examinar. Um método alternativo interessante para contornar este problema é o método agitador magnético / isolamento por filtragem seguida por detecção de larvas por um teste de aglutinação em látex. No entanto, de acordo com a legislação da UE este método só é considerado equivalente para o ensaio de carne de suínos domésticos, mas não para os animais que estão em maior risco de infecção como javali 4. A identificação do antigénio de larvas com anticorpos monoclonais torna o teste mais objectiva, mas nega o laboratório a possibilidade de determinar o número de larvas por grama de carne 16. Outras variações do método de agitador magnético incluem a técnica de método / sedimentação digestão de amostras combinadas assistida mecanicamente, a escavação amostra colectiva assistida mecanicamenteMétodo estion / na técnica de isolamento do filtro, eo método de digestão automática de amostras combinadas técnica de até 35 g. Estas técnicas são todas baseadas na digestão artificial da carne e a visualização e a contagem de larvas de Trichinella, mas diferem no equipamento utilizado para os passos de filtração e sedimentação. As larvas isolado pode ainda ser identificado ao nível da espécie por um teste molecular (por exemplo, PCR multiplex) 17. De acordo com a legislação da UE, todas as amostras positivas devem ser encaminhadas para o laboratório nacional de referência ou para EURLP para a determinação da espécie de triquinas.

Nemátodos do género Trichinella pode ser detectado em músculos estriados de carnívoros e onívoros mamíferos, aves e répteis em todo o mundo. Estes nematóides zoonóticas pode atingir os seres humanos quando crus ou carne semi-cru e produtos de carne derivados de suínos, cavalos e animais de caça são ingeridos. Esta zoonose pode ser uma doença grave em humanos caracterizados por sinais patognomônicos e sintomas, por exemplo, diarreia, febre, edema periorbital e mialgia e possíveis complicações como miocardite, doença tromboembólica e encefalite 1. Trichinella spiralis é o agente etiológico mais comum de infecção por triquinas em animais domésticos e selvagens e faz com que a maioria das infecções humanas em todo o mundo. Na Europa, Norte e Oeste da África e Ásia Ocidental, Trichinella britovi é outra fonte de infecções humanas. Além disso, outros dez táxons são menos comumente relatada como o causador<html> agentes da doença humana e são encontrados em diferentes regiões do mundo, geralmente em 2 animais selvagens. Além de animais selvagens, como javalis, ursos, morsas e texugos, carne de porco representa a mais importante fonte de infecção humana no mundo inteiro. A melhor maneira de evitar a triquinose é abster-se de comer produtos de carne crua e cozinhar qualquer carne, especialmente carne de caça a temperaturas seguras (&gt; 65 ° C durante 1 min, ou seja, para mudar a cor da carne do rosa ao marrom no núcleo do produto de carne) 3. A União Europeia e USDA tenha especificado tempos e temperaturas de congelamento e de culinária para os produtos suínos que podem ser usados para matar larvas de T. spiralis na carne 4, 5. Além disso, as recomendações para a inactivação de triquinas na carne e produtos à base de carne foram publicados pela Comissão Internacional sobre a triquinose&quot;xref&quot;&gt; 6. Na Europa, além da introdução de condições de habitação controladas em rebanhos suínos comerciais onde o risco de infecção Trichinella é desprezível, a prevenção da triquinose humana baseia-se na análise laboratorial de amostras de músculo de animais suscetíveis 4. Para fins de segurança alimentar, ensaios de digestão são os únicos procedimentos confiáveis para a detecção direta de larvas de triquinas na carne 3, 7. Mesmo se houver várias variações do ensaio de digestão, o método de agitação magnética é o método internacionalmente aceite de referência 3, 4, 7. Este ensaio baseia-se na detecção de Trichinella larvae em tecidos do músculo estriado. Após a digestão enzimática de amostras de músculo e subsequentes etapas de filtração e sedimentação, Trichinella larvas são identificados por microscopia. Dependendo obrigações comerciais e legislação nacional, há uma infinidade de pequenas variações no protocolo geral do método de agitador magnético. Aqui, detalhes técnicos são baseados nas exigências da UE 4, especificações ISO 8, diretrizes de TIC 6, ea experiência do Laboratório de Referência da União Europeia para Parasitas (EURLP) e do Laboratório alemão de referência para Trichinella.

<table><tbody><tr><td>Knife, Scissors, Tweezers</td><td></td><td></td><td>Cutting samples and removing non-digestible tissue</td></tr><tr><td>Blender&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>With a sharp chopping blade</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td></td><td></td><td>With thermostatically controlled heating plate</td></tr><tr><td>Stirring Rod</td><td></td><td></td><td>Teflon-coated, approximately 5 cm long</td></tr><tr><td>Conical glass separation funnel</td><td></td><td></td><td>Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.</td></tr><tr><td>Stands, rings and clamps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieve</td><td></td><td></td><td>Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh</td></tr><tr><td>Funnel</td><td></td><td></td><td>Internal diameter not less than 12&amp;nbsp;cm, to support the sieves</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td></td><td></td><td>Capacity 3 L</td></tr><tr><td>Glass measuring cylinder</td><td></td><td></td><td>Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td></td><td></td><td>With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td></td><td></td><td>9 cm diameter, marked on their undersides into 10 &amp;times; 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope</td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td>Alternatively a lid to cover the beakers</td></tr><tr><td>25% hydrochloric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td></td><td></td><td>Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (F&amp;eacute;d&amp;eacute;ration internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>70-90% ethyl alcohol</td></tr><tr><td>Tap water</td><td></td><td></td><td>Heated to 46-48 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Balance</td><td></td><td></td><td>Accurate to at least 0.1 g</td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td>Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice</td></tr><tr><td>Pipettes and pipette holder</td><td></td><td></td><td>Different sizes (1, 10 and 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Accurate to 0.5 &amp;deg;C, temperature range at least from 20 &amp;deg; C to 70&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siphon</td><td></td><td></td><td>For tap water</td></tr></tbody></table>

magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples

Triquinose é uma doença debilitante em seres humanos e é causada pelo consumo de carne crua ou mal cozida de animais infectados com larvas de nematóides do género Trichinella. As fontes mais importantes de infecções humanas em todo o mundo são carne de caça e carne de porco ou produtos suínos. Em muitos países, a prevenção da triquinelose humana baseia-se na identificação de animais infectados por meio da digestão artificial de amostras de músculo de carcaças de animais susceptíveis. Existem vários métodos baseados na digestão da carne, mas o método de agitador magnético é considerada o padrão de ouro. Este método permite a detecção de larvas de Trichinella por microscopia após a digestão enzimática das amostras de músculo e subsequentes passos de filtração e sedimentação. Embora este método não requer equipamento especial e caro, controlos internos não pode ser utilizado. Portanto, a gestão de qualidade rigoroso deve ser AplicD ao longo do teste. O objetivo do presente trabalho é fornecer instruções de manuseio detalhadas e pontos críticos de controle do método com analistas, com base na experiência do Laboratório de Referência da União Europeia para Parasitas e do Laboratório Nacional de Referência da Alemanha para Trichinella.

<html> Após a digestão, a forma das larvas infectantes muscular pode variar, tornando a identificação mais difícil. Formas típicas incluem larvas bem enrolada, larvas levemente enrolada ou em forma de C ou larvas completamente desenrolado (Figuras 2B - 2C). O número de larvas encontradas por grama pode variar consideravelmente e pode variar de uma larva de algumas centenas de larvas. A morfologia da larva músculo infecciosa é mostrado na Figura 2A. Trichinella larvas são de 0,7 a 1,5 mm de comprimento e aproximadamente 0,3 mm de largura. O esôfago é estreito e tem uma extremidade ligeiramente arredondada. A cutícula é suave. Na metade anterior da cavidade do corpo, o stichosome, uma estrutura constituída por um tubo delgado longo rodeado por uma fileira de 45 a 55 células grandes (stichocytes), pode ser observada. O reto também é arredondada, sem quaisquer projecções ou apêndices 10, 11. t &quot;&gt; Outras estruturas, além de larvas de Trichinella, podem ser encontrados após a digestão do músculo Alguns exemplos são mostrados nas Figuras 3A -.. 3F animais selvagens são frequentemente infectados com outros parasitas ou as amostras de músculo disponíveis para testes são contaminadas durante o processo de evisceração por animado ou estruturas inanimados / organismos. o comprimento das larvas, a aparência das extremidades anterior e posterior e a ocorrência da ajuda stichosome para discriminar entre os vários géneros de nemátodos 12. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> Figura 1: exame microscópico de Trichinella Larvas após (a) insuficiente e (B) Passos Enxaguamento suficiente. As barras de escala indicam a 100 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior ve</a>rsion desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> Figura 2: Morfologia do infecciosa Trichinella Larvas Mostrando reto, Stichosome e Esôfago do Larva (A). Possíveis formas de larvas muscular após digestão que mostra (B) bem enrolada e levemente enrolada larvas e (C) que se move desenrolado larvas. As barras de escala indicam a 100 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> Figura 3: Exemplos de Achados ao fundo após a digestão de Muscle As amostras com o Magnetic Método Agitador. (A) de cabelo cerdas-like deverme terra encontrada em javali; (B) Alaria alata de javali; (C) da fibra muscular de javali; (D) Metastrongylus sp. de javali; Fibras (E) planta encontrada no javali (F): Toxocara sp. larva de javali. As barras de escala indicam a 100 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

A prevenção da triquinose humana em muitos países do mundo baseia-se na análise laboratorial de amostras de músculo de animais susceptíveis por métodos de digestão, dos quais o método de agitador magnético é considerada o padrão ouro.

Método agitador magnético para Detecção de<em&gt; Trichinella</em&gt; As larvas em amostras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

28.6K visualizações.  Federal Institute for Risk Assessment.  A prevenção da triquinose humana em muitos países do mundo baseia-se na análise laboratorial de amostras de músculo de animais susceptíveis por métodos de digestão, dos quais o método de agitador magnético é considerada o padrão ouro. 

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Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris Muris Infecção: Um Modelo de imunidade do tipo 2 e inflamação no intestino

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Imunologia e Infecção

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biologia

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Biologia do Desenvolvimento

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Neurociência

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Medicina

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Visualização de redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor em destaque: Compreendendo a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares de Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Método agitador magnético para Detecção de

Resumo

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